產(chǎn)品描述

IHC Kit for Rabbit Primary Antibody可用于檢測以兔單克隆或多克隆抗體為一抗的免疫組化實驗，檢測原理基于高特異性高親和力的鏈霉親和素-生物素結(jié)合：已固定或培養(yǎng)細(xì)胞的抗原與一抗形成抗原抗體復(fù)合物，生物素化二抗特異性結(jié)合上述復(fù)合物，經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素特異性識別生物素（即抗原所在位置），最后經(jīng)辣根過氧化物酶底物顯色即可檢測相應(yīng)抗原。

本品可適用于多種類型樣本，如石蠟包埋切片、冰凍切片、培養(yǎng)細(xì)胞涂片及血液標(biāo)本等。

 

產(chǎn)品組分

組分	組分編碼	組分名稱	產(chǎn)品編號/規(guī)格	儲存條件
Part Ⅰ	36312-A	1×PBS 緩沖液（干粉，4L）	2L×2瓶	室溫
	36312-B	100×檸檬酸鈉抗原修復(fù)液	32 mL	2-8℃
	36312-C	內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（即用型）	5 mL	2-8℃
	36312-D	抗體稀釋液（即用型）	5 mL	2-8℃
	36312-E	封閉用正常山羊血清工作液（即用型）	5 mL	2-8℃
	36312-F	生物素標(biāo)記羊抗兔 IgG（即用型）	5 mL	2-8℃
	36312-G	辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液（即用型）	5 mL	2-8℃
	36312-J	蘇木素染液（即用型）	6 mL	室溫
Part Ⅱ	36312-H	DAB kit (20×)顯色液	0.5 mL	-20℃
	36312-I	DAB kit (20×)稀釋液	0.5 mL	-20℃

 

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。Part Ⅱ，H,I組分-20℃保存，其他組分4℃保存，有效期1年。勿冰凍！

 

注意事項

1.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2.DAB是一潛在致癌物，使用時請注意自我防護(hù)。

3.檢測樣本時需同時做陰性對照和陽性對照。

4.本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

準(zhǔn)備試劑

二甲苯、乙醇、甲醇、去離子水、封片劑（Cat#36313）

 

使用方法

1.脫蠟水化:將石蠟切片置于新鮮二甲苯中浸泡15 min，重復(fù)三次。去除多余的液體后，依次置于無水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡5 min，蒸餾水（或自來水）沖洗5 min。用PBS緩沖液（試劑A，將干粉溶解于2 L去離子水中）沖洗切片5 min，重復(fù)三次。

2.抗原修復(fù):將脫蠟水化后的組織切片置于燒杯（或修復(fù)盒）中的耐高溫塑料切片架上，加適量修復(fù)液1×檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（試劑B，將100×檸檬酸鈉抗原修復(fù)液加去離子水稀釋成1×檸檬酸鈉抗原修復(fù)液），液面要浸過切片組織一定高度，將修復(fù)盒置于沸水中煮沸修復(fù)15 min后取出玻片，自然涼至室溫。用PBS緩沖液沖洗切片5 min，重復(fù)三次。注意：抗原修復(fù)時，修復(fù)液務(wù)必保證切片始終浸泡在液體內(nèi)，一般情況：修復(fù)液的量約為800 mL/1架。

3.阻斷內(nèi)源性過氧化物酶:用吸水紙擦干玻片，免疫組化筆在組織周圍畫圈，滴加50 μL內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（試劑C）到切片組織上以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，室溫孵育30 min，用PBS緩沖液沖洗切片5 min，重復(fù)三次。

4.血清封閉:用吸水紙擦干玻片，滴加50 μL正常山羊血清工作液（試劑E），37℃封閉20 min，以減少非特異性染色。

5.一抗孵育:用抗體稀釋液（試劑 D）將一抗原液稀釋成工作液，用吸水紙擦干玻片組織周圍的液體，滴加適量抗體工作液，置于孵育盒4℃孵育過夜或37℃孵育1h-2h。

6.復(fù)溫:4℃過夜后從冰箱拿出樣本，在室溫下孵育15 min復(fù)溫（抗體孵育為4℃過夜選用此步驟，如室溫孵育直接進(jìn)入下一步清洗）。用PBS緩沖液沖洗切片5 min，重復(fù)三次。

7.二抗孵育:吸水紙擦干切片后滴加50 μL生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG（試劑F），37℃孵育20 min，用PBS緩沖液沖洗切片5 min，重復(fù)三次。

8.三抗孵育:吸水紙擦干切片后滴加50 μL 辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素孵育（試劑G），37℃孵育20 min，用PBS緩沖液沖洗切片5 min，重復(fù)三次。

9.顯色:甩去 PBS 緩沖液，吸水紙擦干切片；每張切片滴加新鮮配制的DAB工作液50 μL（試劑H：試劑I：試劑A=1:1:18比例配置），孵育3-5 min，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，切勿顯色過深；顯色后用自來水沖洗切片終止顯色。

【注】:1. DAB顯色液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避光放置，且在30 min內(nèi)使用。

2.可根據(jù)需要一次染多張切片，各種試劑量按照上述比例放大即可。

10.復(fù)染:滴加適量蘇木素染液（試劑J）復(fù)染，孵育1-5 min，自來水沖洗5 min，滴加鹽酸酒精分化液分化30 sec，自來水沖洗。

11.脫水封片:將玻片依次置于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇，各浸泡 5 min，再將玻片放入二甲苯

中浸泡15 min，重復(fù)三次。玻片取出來稍晾干，用中性樹膠封片。

12.結(jié)果判定:

在光學(xué)顯微鏡下對染色的切片觀察并判斷。蘇木素染細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯色的陽性表達(dá)為棕黃色。

 

HB221025