產(chǎn)品簡(jiǎn)介

 

Anti-Flag免疫磁珠（Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads）是一種聚合物磁性微球，由高質(zhì)量的鼠源抗DYKDDDDK (Flag) 單克隆抗體與粒徑為200 nm的硅基磁珠通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)制備，本產(chǎn)品具有快速的磁響應(yīng)性，超順磁性、良好的分散性、粒徑均一、極低的非特異結(jié)合和豐富的結(jié)合位點(diǎn)等特點(diǎn)，可用于帶有Flag標(biāo)簽的蛋白免疫沉淀（IP）或免疫共沉淀（Co-IP）。

Anti-Flag免疫磁珠（Anti-DYKDDDDK (Flag) MagBeads）可結(jié)合Met修飾的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag融合蛋白（Protein-FLAG）。

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產(chǎn)品性質(zhì)

 

基質(zhì)（Matrix  spherical）	硅基磁珠
配體（Ligand）	Anti-Flag Antibody
結(jié)合能力（Binding Capacity）	≥0.6 mg Flag標(biāo)簽融合蛋白/mL磁珠
粒徑（Particle size）	200 nm
磁珠濃度（Concentration）	10 mg/mL
儲(chǔ)存緩沖液（Storage Buffer）	PBS, 0.01% Tween-20, 0.02% NaN3
應(yīng)用（Application）	IP、Co-IP等

 

儲(chǔ)存條件

 

2~8℃保存，有效期1年。避免凍存！

 

使用說(shuō)明

 

以免疫沉淀（IP）為例，步驟如下：

1. 緩沖液配制

【注】建議以下緩沖液在使用前用 0.22 μm 或 0.45 μm 濾膜過(guò)濾。

裂解緩沖液：0.15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, pH7.4或WB/IP裂解液（Cat#20118ES）

平衡/結(jié)合/洗雜緩沖液：0.15 M NaCl, 20 mM Na₂HPO₄, pH7.0

洗脫緩沖液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

中和緩沖液：1 M Tris-HCl，pH 8.5

2. 樣品準(zhǔn)備

本操作說(shuō)明書(shū)提供以下三種樣品處理方法，建議您根據(jù)不同來(lái)源的樣品選擇適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行預(yù)處理，使待檢測(cè)蛋白釋放至樣品溶液中。

血清樣品處理：若目標(biāo)蛋白豐度較高， 建議用結(jié)合緩沖液稀釋血清樣品至目標(biāo)蛋白終濃度為10-100 µg/mL，置于冰上備用(或置于-20℃長(zhǎng)期保存)。

懸浮細(xì)胞樣品處理：離心收集細(xì)胞（4℃, 1000g, 5 min），用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM）。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長(zhǎng)期保存）。

貼壁細(xì)胞樣品處理：移去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞兩遍；用細(xì)胞刮棒刮脫細(xì)胞，收集至1.5mL EP管內(nèi)，按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液（裂解液應(yīng)在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mM）。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。混勻后置于冰上處理10 min；離心收集上清液（4℃, 14000g, 10 min），置于冰上備用（或置于-20℃長(zhǎng)期保存）。

3. 磁珠預(yù)處理

3.1用移液器輕柔吹打Anti-Flag免疫磁珠，使其充分混懸，取25~50 µL 磁珠懸液置于1.5 mL離心管中。

3.2加入500 µL IP Lysis/Wash Buffer并輕輕移液器混合，用移液器輕柔吹打重懸Anti-Flag免疫磁珠，放置在磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄上清。重復(fù)洗2次。

4. 樣品的結(jié)合

4.1在預(yù)處理后的磁珠中加入含有Flag標(biāo)簽的蛋白樣品，置于翻轉(zhuǎn)混合儀上孵育(常溫1~2 h，或4℃過(guò)夜)；

4.2將上述混合液置于磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后，把上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中備用(上清液可用于檢測(cè)Flag標(biāo)簽蛋白是否存在殘留)，原離心管中剩余的即為蛋白-磁珠復(fù)合物；

注意：結(jié)合過(guò)程中，磁珠可能會(huì)出現(xiàn)聚團(tuán)或呈片狀，屬于正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5. 洗滌

5.1向上述步驟4.2所得的蛋白-磁珠復(fù)合物中加入1000 µL IP Lysis/Wash Buffer，輕柔混勻磁珠5~10 min，接著在磁力架上靜置，大約1 min，待溶液變澄清后后, 吸棄上清；

5.2重復(fù)步驟5.1兩次，直至洗滌后的上清液OD280小于0.05為止；

注意：如上清液的OD280仍大于0.05，則適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。

6. 蛋白洗脫

根據(jù)下游用途選擇洗脫方法。

6.1 Flag融合蛋白洗脫

1）配制Flag多肽洗脫液：TBS中溶解Flag多肽，終濃度為0.2-1 mg/mL。

2）分別加入100 μL Flag多肽洗脫液，4℃孵育 2 h-6 h（慢慢搖晃）

3）分離磁珠上的磁珠并保存含有目標(biāo)抗原的上清液。

4）重復(fù)洗脫步驟一次以獲得更高的回收率

6.2 酸性洗脫（0.1 M Gly-HCl，pH 3.0）

1）加入100 μL 0.1 M Gly-HCl，pH 3.0，室溫孵育5-10 min（慢慢搖晃）。

2）分離磁珠上的磁珠并保存含有目標(biāo)抗原的上清液。

3）中和低pH，每100 μL洗脫液加入20 μL中和緩沖液(1 M Tris-HCl，pH 8.5)。

6.3 用SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫

如需直接檢測(cè)目的蛋白，則在上述洗滌過(guò)的蛋白-磁珠復(fù)合物中加入80~100 μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸 10 min，冷卻至室溫并在磁力架上分離磁珠，取上清進(jìn)行 SDS-PAGE 檢測(cè)。

 

注意事項(xiàng)

 

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套操作。

Ver.CN20240801