HEK293宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒是用于定量分析檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中的HEK293殘留DNA含量的試劑盒。

本試劑盒采用探針法熒光定量PCR原理，可專一快速的檢測HEK293細胞的殘留DNA，其最低檢測限可以達到fg水平；且試劑盒中含有UDG酶，可以消除擴增產(chǎn)物帶來的污染。該試劑盒可與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

產(chǎn)品組分

組分編號	組分名稱	產(chǎn)品編號/規(guī)格
		41306ES50  (50T)	41306ES60  (100T)
41306-A	HEK293 qPCR Mix (UDG plus)	0.75 mL	1.5 mL
41306-B	HEK293 Primer&Probe Mix	250 μL	500 μL
41306-C	DNA Dilution Buffer	2×1.8 mL	4×1.8 mL
41306-D	HEK293 DNA Control (30 ng/μL)	25 μL	50 μL

 

運輸和保存方法

1. 所有組分均干冰運輸，-20℃保存，有效期2年。且41306-A和41306-B均需避光保存。

2. 收到貨后，請檢查共4個組分是否齊全，并立即放入對應的保存溫度中儲存。

 

注意事項

1. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應規(guī)范操作，包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。

2. 每個組分在使用前都應充分震蕩混勻，低速離心。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

4. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

 

適用機型

包含但不限于以下儀器：

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5，ABI Step OnePlus；

上海宏石醫(yī)療科技：SLAN-96S。

 

使用方法

一、HEK293 DNA定量參考品的稀釋和標準曲線的制備

用試劑盒中提供的DNA稀釋液將DNA定量參考品進行梯度稀釋，稀釋濃度依次為300 pg/μL，30 pg/μL，3 pg/μL，300 fg/μL，30 fg/μL。

具體操作如下：

1. 將試劑盒中的HEK293 DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。

2. 取6支潔凈的1.5 mL離心管，分別標記為Std0，Std1，Std2，Std3，Std4，Std5。

3. 在標記為Std0的1.5 mL離心管中加入90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL HEK293 DNA Control (30 ng/μL)，即稀釋為3ng/μL，振蕩混勻后短時間快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-20℃短期保存（不超過3個月），使用時避免反復凍融。

4. 在Std1，Std2，Std3，Std4，Std5管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer，再進行梯度稀釋，稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 pg/μL
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 pg/μL
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	3 pg/μL
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	300 fg/μL
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	30 fg/μL

【注】：

1. 每個濃度做3個復孔，該試劑可測試30 fg/μL-300 pg/μL線性范圍。若需要，可適當擴大或縮小線性范圍。

2. 為減少反復凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-20℃。

3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天，若長時間不用，請放置于-20℃。

4. 為確保模板完全混勻，每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻約1 min。

 

二、樣本加標回收質(zhì)控ERC的制備

根據(jù)需要設置ERC中的HEK293 DNA標準品濃度（以制備加30 pg HEK293 DNA量的ERC為例），具體操作如下：

1. 取100 μL待測樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std3，混勻，標記為ERC。

2. 加標回收ERC和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備加標回收ERC純化液。

 

三、陰性抽提質(zhì)控NCS的制備

根據(jù)實驗設置陰性抽提質(zhì)控NCS，具體操作如下：

1. 取100 μL樣本基質(zhì)溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標記為NCS。

2. 陰性質(zhì)控NCS和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控NCS純化液。

 

四、無模板對照NTC的制備

根據(jù)實驗設置無模板對照NTC，具體操作如下：

1. 無模板對照NTC無需進行樣本前處理，在qPCR法檢測殘留DNA含量階段開始配置即可。

2. 每管或孔中的NTC反應體系為20 μL Mix混合液（即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5μL HEK293 Primer&Probe Mix）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個重復孔的量。

 

五、反應體系

組分	體積（μL）
HEK293 qPCR Mix (UDG plus)	15
HEK293 Primer&Probe Mix	5
DNA template	10
總體積	30

【注】：

1. 根據(jù)反應孔數(shù)計算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液=（反應孔數(shù)+2）× (15+5) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個樣本做3個重復孔。

2. 反應孔數(shù)=（5個濃度梯度的標準曲線+1個無模板對照NTC+1個陰性抽提質(zhì)控NCS+待測樣本TS個數(shù)+待測樣本對應加標回收ERC個數(shù)）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：樣本基質(zhì)溶液或DNA Dilution Buffer進行樣本前處理后，所得純化液為NCS

TS (Test Sample)：待測樣本

ERC (Extraction Recovery Control)：待測樣本中加入如30 pg標準品DNA后進行樣本前處理，所得純化液為加標回收ERC

3. 加樣完成密封好管子后，請低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完全混勻反應液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

下圖為參考板位：

該示例是對HEK293殘留DNA qPCR法檢測操作的展示，檢測樣本包括：5個濃度梯度的HEK293 DNA標準曲線、1個無模板對照NTC、1個陰性質(zhì)控NCS、3個待測樣本TS、3個加樣回收ERC。建議每個樣本做3個重復孔。

 

六、擴增程序參數(shù)設置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）

1. 創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。

2. 創(chuàng)建1個檢測探針，命名為“HEK293-DNA”，選擇報告熒光基團為“FAM”，猝滅熒光基團為“none”，參比熒光為“ROX”（參比熒光可根據(jù)儀器型號等情況，選擇是否需要添加）。

3. 在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，將標準曲線孔的“Task”一欄設置為“Standard”，并且在“Quantity”一欄分別賦值為“300000”，“30000”，“3000”，“300”，“30”（含義為每孔的DNA濃度，單位為fg/μL），并且在相應的“sample name”一欄中命名為“300 pg/μL”，“30 pg/μL”，“3 pg/μL”，“300 fg/μL”，“30 fg/μL”；將無模板對照NTC孔的“Task”一欄設置為“NTC”；將陰性質(zhì)控NCS孔、待測樣本TS孔、樣本加標回收ERC孔的“Task”一欄設置為“Unknown”，并且在相應的“Sample Name”一欄中分別命名為“NCS”，“TS”，“ERC”；之后點擊“Start Run”，開始儀器運行。

4. 擴增程序設置：設置反應體積30 μL。

循環(huán)步驟	溫度(℃)	時間	循環(huán)數(shù)
擴增產(chǎn)物消化	37℃	5 min	1
預變性	95℃	10 min	1
變性	95℃	15 sec	40
退火/延伸（收集熒光）	60℃	30 sec

 

七、qPCR 結(jié)果分析

1. 在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系統(tǒng)會自動給出“Threshold”，有時系統(tǒng)給出的“Threshold”離基線太近，導致復孔之間Ct相差甚遠，可手動調(diào)節(jié)“Threshold”至合適位置，點擊“Analyze”。此時可在“Multicomponent Plot”初步查看擴增曲線的形態(tài)是否正常。

2. 在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可讀取標準曲線的R²、擴增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的標曲：R²>0.99，擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內(nèi)，Slope在-3.6~-3.1。

3. 在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質(zhì)控NCS、待測樣本TS、樣本加標回收ERC的檢測值，單位為fg/μL，后續(xù)可在檢測報告中將單位換算成pg/μL或pg/mL。

4. 結(jié)果分析的參數(shù)設置需依據(jù)具體的機型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動判讀。

5. 根據(jù)待測樣本TS和樣本加標回收ERC的檢測結(jié)果計算加標回收率，加標回收率要求在50%~150%之間。加標回收率計算公式：回收率(%) = {樣本加標測定值(eg.pg/µL)-樣本測定值(eg.pg/µL)} x洗脫體積(µL) / DNA加入量理論值(eg.pg) x 100%。

6. 陰性質(zhì)控NCS的Ct值應大于標曲最低濃度Ct的均值。

HB221130