產(chǎn)品描述

Bradford蛋白濃度測(cè)定法是目前常用的靈敏度較高的蛋白濃度測(cè)定方法之一。它是根據(jù)Bradford染液（考馬斯亮藍(lán)G-250染料）與蛋白結(jié)合，使染料的最大吸收峰從A456變?yōu)锳595，且測(cè)定的吸光值與蛋白濃度成正比關(guān)系的原理設(shè)計(jì)的。本法通過吸光值，推算蛋白濃度，實(shí)現(xiàn)了蛋白濃度測(cè)定的快速性和簡(jiǎn)便性。靈敏度高，比Lowry法大約高四倍，最低蛋白檢測(cè)量可達(dá)1μg。測(cè)定速度快、簡(jiǎn)單，僅需一種試劑即可，且不受大多數(shù)樣品中化學(xué)試劑的影響。

我司提供二種規(guī)格的Bradford蛋白濃度檢測(cè)試劑盒，比色皿法分別可做125次和625次。酶標(biāo)法分別可做500次和2500次。

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產(chǎn)品組分

編號(hào)	組分	產(chǎn)品編號(hào)/規(guī)格
		20202ES76   (500T)	20202ES86   (2500T)
20202-A	Bradford蛋白染色液	125mL	5×125 mL
20202-B	蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）	5×1mL（2mg/mL）	5×2mL（2mg/mL）

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。染色液4℃保存，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品常溫或4℃保存，有效期一年。

注意事項(xiàng)

1）Bradford染色液使用前，應(yīng)充分混勻。同時(shí)，酶標(biāo)儀需預(yù)熱20min。

2）Bradford染色液需恢復(fù)到室溫再使用，有利于提高檢測(cè)的靈敏度。另，使用前需顛倒幾次以充分混勻。

3）由于Bradford染液的顏色反應(yīng)并不是同遞增的蛋白濃度呈線性關(guān)系，因此每次試驗(yàn)都必須建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。另外，為了得到更精確的結(jié)果，每個(gè)蛋白梯度和樣品均需做復(fù)孔。

4）Bradford法測(cè)定蛋白濃度對(duì)大多數(shù)化學(xué)物質(zhì)的兼容性比較好，比如對(duì)還原劑DTT的兼容性高達(dá)5mM。但會(huì)受到略高濃度的去垢劑影響，如，SDS需低于0.01%，Triton X-100低于0.05%，Tween 20/ 60/80低于0.015%等。對(duì)于含去垢劑的樣品，建議使用BCA增強(qiáng)型蛋白定量檢測(cè)試劑盒【貨號(hào)：20201ES76】。

5）為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

6）本產(chǎn)品僅作科研用途！

操作方法

一、配制標(biāo)準(zhǔn)品

1. 配制BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系

注：標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為蛋白樣品的溶解液，原則上蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS進(jìn)行稀釋。

BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系配制可參考表一。

表一BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系配制（微孔板檢測(cè)，線性范圍100-1500μg/mL）

Vial	稀釋液體積(μL)	2mg/mL BSA體積(μL)	BSA終濃度(μg/mL)
A	0	100	2000
B	25	75	1500
C	50	50	1000
D	125	75	750
E	150	50	500
F	350	50	250
G	375	25	125
H	395	5	25
I	400	0	0=Blank

二、檢測(cè)方法

A. 標(biāo)準(zhǔn)比色皿檢測(cè)（線性范圍：100-1500μg/mL）

1. 各取20μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入到反應(yīng)管中；

2. 加入1mL Bradford染色液，混勻。室溫孵育10min。【注】：樣本室溫孵育時(shí)間不可超過1h；

3. 分光光度計(jì)上測(cè)定595nm處的吸光度，用裝滿水的比色皿對(duì)儀器校零。之后測(cè)定所有樣本濃度。

4. 根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的OD值即最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X-蛋白濃度μg/mL；Y-最終的OD595nm）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品蛋白濃度。

B. 標(biāo)準(zhǔn)微孔板檢測(cè)（線性范圍：100-1500μg/ml）

1. 各取5μL各濃度標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品加入到微孔板中；

2. 每孔加入250μL Bradford染色液，振蕩30s充分混勻。蓋上微孔板，室溫孵育10min。【注】：樣本室溫孵育時(shí)間不可超過1h；

3. 酶標(biāo)儀上測(cè)定595nm處的吸光度?；蛘咂渌?75-615nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，但是相對(duì)于595nm，吸光度會(huì)存在0-10%的損失。

4. 根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的OD值即最終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X-蛋白濃度μg/mL；Y-最終的OD595nm）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品蛋白濃度。

注：a）由于酶標(biāo)板的光徑比比色皿短，經(jīng)酶標(biāo)板檢測(cè)得到的OD595nm會(huì)低于比色皿檢測(cè)所得，因此可能降低本法的檢測(cè)下限。要得到更高的OD595nm，可使用7-10μL標(biāo)準(zhǔn)品/待檢樣本，和250μL Bradford染色液來進(jìn)行檢測(cè)。b）如果使用與酶標(biāo)儀相關(guān)的曲線擬合算法（curve fitting algorithm），那么四參數(shù)或者最佳擬合曲線可能得到更為精確的結(jié)果，并不是單純的線性擬合。若是手動(dòng)標(biāo)記各點(diǎn)濃度，點(diǎn)-點(diǎn)曲線出來的結(jié)果精確于線性擬合。若對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性的要求不是非常嚴(yán)格，可使用線性擬合分析數(shù)據(jù)。

附錄        
                                                                                     表：Brandford蛋白濃度測(cè)定的兼容性

名稱（鹽/緩沖液）	耐受濃度
ACES, pH 7.8	100mM
Ammonium sulfate	1M
Asparagine	10mM
Bicine, pH 8.4	100mM
Bis-Tris, pH 6.5	100mM
Borate (50mM), pH 8.5	undiluted
Calcium chloride in TBS, pH 7.2	10mM
Na-Carbonate/Na-Bicarbonate (0.2M), pH 9.4	undiluted
Cesium bicarbonate	100mM
CHES, pH 9.0	100mM
Na-Citrate (0.6M), Na-Carbonate (0.1M), pH 9.0	undiluted
Na-Citrate (0.6M), MOPS (0.1M), pH 7.5	undiluted
Cobalt chloride in TBS, pH 7.2	10mM
EPPS, pH 8.0	100mM
Ferric chloride in TBS, pH 7.2	10mM
Glycine	100mM
Guanidine•HCl	3.5M
HEPES, pH 7.5	100mM
Imidazole, pH 7.0	200mM
MES, pH 6.1	100mM
MES (0.1M), NaCl (0.9%), pH 4.7	undiluted
MOPS, pH 7.2	100mM
Nickel chloride in TBS, pH 7.2	10mM
PBS; Phosphate (0.1M), NaCl (0.15M), pH 7.2	undiluted
PIPES, pH 6.8	100mM
RIPA lysis buffer; 50mM Tris, 150mM NaCl,0.5%   DOC, 1% NP-40, 0.1% SDS, pH 8.0	1/10 dilution*
Sodium acetate, pH 4.8	180mM
Sodium azide	0.5%
Sodium bicarbonate	100mM
Sodium chloride	5.0M
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4	200mM
Sodium phosphate	100mM
Tricine, pH 8.0	100mM
Triethanolamine, pH 7.8	100mM
Tris	2M
TBS; Tris (25mM), NaCl (0.15M), pH 7.6	undiluted
Tris (25mM), Glycine (192mM), pH 8.0	undiluted
Tris (25mM), Glycine (192mM), SDS (0.1%), pH   8.3	1/2 dilution*
Zinc chloride in TBS, pH 7.2	10mM

 

名稱（變性劑）	耐受濃度	還原劑以及巰基試劑	耐受濃度
Brij™-35	0.125%	Dithiothreitol (DTT)	5mM
Brij-56, Brij-58	0.031%	Glucose	1M
CHAPS, CHAPSO	5.0%	Melibiose	100mM
Deoxycholic acid	0.05%	2-Mercaptoethanol	1M
Lubrol™ PX	0.125%	Potassium thiocyanate	3M
Octyl β-glucoside	0.5%	Thimerosal	0.01%
Nonidet P-40 (NP-40)	0.5%	Misc.   Reagents & Solvents	耐受濃度
Octyl β-thioglucopyranoside	3.0%	Acetone	10%
SDS	0.125%	Acetonitrile	10%
Span™ 20	0.5%	Aprotinin	10mg/L
Triton™ X-100, X-114	0.125%	DMF, DMSO	10%
Triton X-305, X-405	0.5%	Ethanol	10%
Tween™-20	0.062%	Glycerol (Fresh)	10%
Tween-60	0.1%	Hydrochloric Acid	100mM
Tween-80	0.062%	Leupeptin	10mg/L
Zwittergent™ 3-14	0.025%	Methanol	10%
螯合劑	耐受濃度	Phenol Red	0.5mg/mL
EDTA	100mM	PMSF	1mM
EGTA	2mM	Sodium Hydroxide	100mM
Sodium citrate	200mM	Sucrose	10%
還原劑以及巰基試劑	耐受濃度	TLCK	0.1mg/L
N-acetylglucosamine in PBS, pH 7.2	100mM	TPCK	0.1mg/L
Ascorbic acid	50mM	Urea	3M
Cysteine	10mM	o-Vanadate (sodium salt), in PBS, pH 7.2	1mM
Dithioerythritol (DTE)	1mM