Hifair^® V Reverse Transcriptase是在Hieff^® M-MLV (H^-) Reverse Transcriptase基礎(chǔ)上通過基因工程技術(shù)得到的全新逆轉(zhuǎn)錄酶，與Hieff^® M-MLV (H^-) Reverse Transcriptase相比，其熱穩(wěn)定性大幅度提高，可耐受高達(dá)60℃的反應(yīng)溫度，適合具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄。同時，該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。Hifair^® V Reverse Transcriptase合成全長cDNA的能力也有了提升，可擴(kuò)增長達(dá)10 kb的cDNA。

 

產(chǎn)品組分

編號	組分	產(chǎn)品編號/規(guī)格
		14603ES03 (1000 kU)	14603ES25 (25000 kU)	14603ES72 (250000 kU)
14603-A	Hifair® V Reverse Transcriptase (1000 U/μL)	1 mL	25 mL	250 mL

 

產(chǎn)品應(yīng)用

一步法RT-qPCR；基因克?。粺晒舛?。

 

活性定義

以Poly(A) .Oligo(dT)為模板-引物，在37℃，10 min內(nèi)，將1 nmol的dTTP摻入為酸不溶性物質(zhì)所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。

 

運輸與保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，有效期2年。

 

注意事項

1) 請保持實驗區(qū)域潔凈；操作時需穿戴干凈的手套、口罩；實驗所用耗材均需保證RNase free，以防止RNase污染；

2) 所有操作均應(yīng)在冰上進(jìn)行，防止RNA降解；

3) 為保證高效率逆轉(zhuǎn)錄，建議使用高質(zhì)量的RNA樣本；

4) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

 

第一鏈cDNA合成操作步驟

1. RNA變性（此步為可選步驟，RNA變性有助于打開二級結(jié)構(gòu)，可在很大程度上提高第一鏈cDNA的產(chǎn)量）

組分	使用量
RNase free ddH2O	to 13 μL
Oligo (dT)18 (50 μM)	1 μL
or Random Primers (50 μM)	or 1 μL
or Gene Specific Primers (2 μM)	or 1 μL
模板RNA	Total RNA: 1 ng -5 μg或mRNA:1-500 ng

65℃加熱5 min，迅速置于冰上冷卻2 min。簡短離心收集反應(yīng)液后，加入下表中的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，并輕輕吹打混勻。

2. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系配制（20 μL體系）

組分	使用量
上一步的反應(yīng)液	13 μL
10 × Hifair® V Buffer (Cat#15661)	2 μL
dNTP Mix (10 mM)	1 μL
Hifair® V Reverse Transcriptase (1000 U/μL)	0.2 μL
RNase inhibitor (40 U/µL)	1 μL
RNase free ddH2O	to 20 μL

3. 逆轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置

溫度	時間
25℃	5 min
42℃	15-30 min
85℃	5 min

【注】1）當(dāng)使用Random Primers時，需25℃，孵育5 min；若使用Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers，此步可省略。

2）逆轉(zhuǎn)錄溫度：推薦使用42℃。對于高GC含量模板或者復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的模板，可將逆轉(zhuǎn)錄溫度提高至50-55℃。

3）85℃加熱5 min，目的是使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。

※ 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可立即用于后續(xù)PCR或qPCR反應(yīng)，也可-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

※ 該逆轉(zhuǎn)錄酶也適用于一步法RT-qPCR，推薦每25 μL反應(yīng)體系，添加10-20 U逆轉(zhuǎn)錄酶，也可根據(jù)實際情況逐步增加逆轉(zhuǎn)錄酶用量。

 

HB220614