產(chǎn)品描述

細(xì)胞膜/細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒用于快速便捷分離細(xì)胞/組織細(xì)胞膜和細(xì)胞漿蛋白，抽提的膜蛋白不僅包括質(zhì)膜上的蛋白，也包括線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及高爾基體膜等上的膜蛋白。主要工作原理：通過勻漿適度破碎細(xì)胞，經(jīng)低速離心去除細(xì)胞核和少數(shù)未破碎的細(xì)胞產(chǎn)生的沉淀，隨后取上清高速離心獲得細(xì)胞膜沉淀和含有細(xì)胞漿蛋白的上清，然后通過優(yōu)化的膜蛋白抽提試劑從沉淀中抽提獲取膜蛋白。整個過程僅需約90 min即可完成，抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性測定等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

膜蛋白抽提試劑中含有蛋白酶抑制劑、磷酸酯酶抑制劑和EDTA等，后續(xù)不適合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受這些抑制劑影響的酶的活性測定，但抽提獲得的膜蛋白或細(xì)胞漿蛋白適合用于檢測蛋白的磷酸化水平。

按照說明書步驟的用量（細(xì)胞2-5×107個；組織約100 mg），20127ES50/20127ES60可分別進(jìn)行50個和100個樣品的抽提，具體用量可根據(jù)不同的樣品體積進(jìn)行調(diào)整。

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產(chǎn)品組分

組分編號	組分名稱	產(chǎn)品編號/規(guī)格
		20127ES50(50T)	20127ES60(100T)
20127-A	Reagent A試劑A	50 mL	100 mL
20127-B	Reagent B試劑B	15 mL	30 mL

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20℃保存，有效期1年。

注意事項(xiàng)

1）客戶需自備PMSF，PMSF需現(xiàn)配現(xiàn)用，建議在抽提試劑加入到樣品前2-3 min加入，以防失效。

2）利用本試劑盒抽提到的細(xì)胞膜/細(xì)胞漿蛋白可直接用BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)（Yeasen Cat#20201）測定其濃度，但不適合用Bradford法測定。

3）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

4）本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用方法

室溫融解并混勻試劑A和B，融解后立即置于冰上。取適量的試劑A和B備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使其最終濃度為1 mM。

1 樣品準(zhǔn)備

1）細(xì)胞樣品
① 細(xì)胞收集

貼壁細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞約2-5×107個，PBS清洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞或用含有EDTA但不含胰酶的細(xì)胞消化液處理細(xì)胞，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，吸除上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
注：盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。 

懸浮細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞約2-5×107個，離心收集細(xì)胞，吸除上清，留下細(xì)胞沉淀備用。

② 細(xì)胞清洗

用適量冰浴預(yù)冷的PBS輕輕重懸細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計數(shù)，剩余細(xì)胞4℃，600 g離心5 min沉淀細(xì)胞。棄上清，隨后4℃，600 g離心1 min，以沉淀離心管管壁上的殘留液體并進(jìn)一步沉淀細(xì)胞，盡最大努力吸盡殘留液體。

③ 細(xì)胞預(yù)處理：把1 mL試劑A（含PMSF）加入至上述細(xì)胞中，輕輕并充分懸浮細(xì)胞，冰浴放置10-15 min。

2）組織樣品

取約100 mg組織，用剪刀盡量小心剪切成細(xì)小的組織碎片。加入1 mL試劑A（含PMSF），輕輕懸浮組織碎片，冰浴放置10-15 min。

注：如果組織樣品比較少，也可以使用更少的組織量，例如30-50 mg，后續(xù)試劑的用量及操作步驟不變；組織用量較少時，最后獲得的膜蛋白也較少。

2 樣品的破碎及破碎效果的鑒定

① 樣品勻漿：把細(xì)胞懸液或組織樣品轉(zhuǎn)移到一適當(dāng)大小的冰浴預(yù)冷玻璃勻漿器中，勻漿約30-50下?！緞驖{效果與細(xì)胞類型和組織類型相關(guān)，不同細(xì)胞或組織所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化?！?/span>

② 通常在勻漿30次后取約2-3 µL勻漿液滴在蓋玻片上并在顯微鏡下觀察，如見細(xì)胞核周暈環(huán)（A shiny ring around the nuclei）或完整的細(xì)胞形態(tài)，說明細(xì)胞仍完整。如果有70-80%的細(xì)胞均無核周暈環(huán)和完整細(xì)胞形態(tài)，說明細(xì)胞已經(jīng)充分破碎，則進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。否則，重新勻漿10-30次直到細(xì)胞至少70%已經(jīng)破碎。同時記錄對于該細(xì)胞的勻漿次數(shù)，通常在后續(xù)實(shí)驗(yàn)時不必再摸索勻漿次數(shù)。另外需注意特定的勻漿次數(shù)和勻漿器也有關(guān)，需同時注意記錄使用的是哪一個勻漿器。

注：如果沒有適當(dāng)?shù)牟Ａ驖{器，對于培養(yǎng)的細(xì)胞也可以采用反復(fù)凍融法來破碎細(xì)胞。把樣品在液氮和室溫依次反復(fù)凍融兩次，然后取少量樣品在顯微鏡下檢測細(xì)胞破碎的程度。如果細(xì)胞破碎的程度不足70%，可增加凍融次數(shù)，直到細(xì)胞破碎的程度大于70%。

3 去除細(xì)胞核和未破碎的細(xì)胞

 4℃，700 g離心10 min，小心收集上清液至一新的離心管中。

注：吸取上清時切勿接觸沉淀！可以有約30-50 µL上清液殘留不予吸取，以保證吸取的上清液有較高的純度。

4 沉淀細(xì)胞膜碎片

4℃，14,000 g離心30 min，以沉淀細(xì)胞膜碎片。

5 收集細(xì)胞漿蛋白

吸取上清至1新的離心管中，即為細(xì)胞漿蛋白，可-70℃保存?zhèn)溆?。吸取上清時可以有30-50 µL上清殘留，以避免接觸沉淀導(dǎo)致上清樣品被污染。

6 抽提膜蛋白

4℃，14,000 g離心10 s，盡最大努力吸盡上清。可以輕輕觸碰到沉淀，甚至吸走很少量的沉淀。加入試劑B 200 µL（如有必要，也可加大到300 µL），最高速劇烈Vortex 5 s重懸沉淀，冰浴5-10 min。重復(fù)前述步驟的vortex和冰浴孵育1-2次，以充分抽提膜蛋白。隨后，4℃，14,000 g離心5 min，收集上清即為細(xì)胞膜蛋白溶液?？?70℃保存?zhèn)溆?。對于一些有特殊用途的膜蛋白，可自行配制適當(dāng)?shù)哪さ鞍壮樘嵩噭┻M(jìn)行膜蛋白抽提。