產(chǎn)品說明書
FAQ
COA
已發(fā)表文獻(xiàn)
CRISPR/Cas9是一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，源于細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對噬菌體和外源質(zhì)粒的攻擊而演化來的一種獲得性免疫防御機(jī)制。在現(xiàn)代生物技術(shù)研究中，此系統(tǒng)是通過人工優(yōu)化的具有引導(dǎo)作用的sgRNA(Single Guide RNA)引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與sgRNA配對的靶位點(diǎn)處剪切雙鏈DNA，從而引起DNA斷裂。由于生物體內(nèi)非同源末端修復(fù)機(jī)制或同源重組機(jī)制修復(fù)DNA，導(dǎo)致基因移碼突變、替換或刪除，致使基因功能喪失。
Hifair® Precision sgRNA Synthesis Kit采用T7 RNA聚合酶混合物高效轉(zhuǎn)錄spCas9 sgRNA。本試劑盒含有能被Cas9蛋白識別并起支架作用的特異性序列，該序列的一部分能與使用者設(shè)計(jì)的目標(biāo)特異序列部分重疊。退火形成互補(bǔ)鏈后由DNA聚合酶進(jìn)行填充。最終生成用于轉(zhuǎn)錄的dsDNA模板。本試劑盒利用其提供的試劑和使用者自己設(shè)計(jì)的特異性DNA序列，單管反應(yīng)可在4小時內(nèi)獲得20-100μg具有功能的sgRNA。
產(chǎn)品組分
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編號 |
組分 |
產(chǎn)品編號/規(guī)格 |
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11355ES25 (25 T) |
11355ES50 (50 T) |
11355ES60 (100 T) |
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11355-A |
10×sgRNA Enzyme Mix |
50 μL |
100 μL |
200 μL |
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11355-B |
10×sgRNA Reaction Buffer |
50 μL |
100 μL |
200 μL |
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11355-C |
2×Canace Enzyme Mix |
312.5 μL |
625 μL |
1.25 mL |
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11355-D |
Scaffold Template |
31.25 μL |
62.5 μL |
125 μL |
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11355-E |
NTPs（25mM each） |
200 μL |
400 μL |
800 μL |
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11355-F |
Control sgRNA Oligo（10μM） |
10 μL |
20 μL |
40 μL |
運(yùn)輸儲存方法
干冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期兩年。
注意事項(xiàng)
1. 反應(yīng)體系中須嚴(yán)格注意不要混入RNase。
2. 實(shí)驗(yàn)器材（如：槍頭、產(chǎn)品管等）注意嚴(yán)格使用 RNase Free用品。
3. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
4. 本產(chǎn)品僅作科研用途！
合成原理
操作流程
1. 上游引物（Target-specific sgRNA oligo）設(shè)計(jì)
A. 引物的5’端：T7啟動子序列加保護(hù)堿基（20nt：TTCTAATACGACTCACTATA）
B. 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：添加0~2個G，添加G的個數(shù)由靶序列的5’端決定，T7啟動子至少需要2個G才能有效轉(zhuǎn)錄。
（注：若特異靶序列已經(jīng)存在2個G，則不需要額外添加，額外的G會降低剪切效率。）
C. 特異的sgRNA靶序列（20nt）：靶DNA序列PAM（NGG）的5’端20nt堿基序列。
D. 引物的3’端：Scaffold Template退火序列（14nt：GTTTTAGAGCTAGA）。
示例：
DNA模板：
上游引物（Target-specific sgRNA oligo）：
2. sgRNA合成
A.sgRNA模板擴(kuò)增
①按下列體系配制反應(yīng)體系：
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組分 |
體積（μL） |
終濃度 |
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RNase free H2O |
Up to 25 |
- |
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Scaffold Template |
1.25 |
- |
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sgRNA Oligo（10μM） |
1.25 |
0.5μM |
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2×Canace Enzyme Mix |
12.5 |
1× |
注： 1. Scaffold Template已預(yù)先與下游引物混合。
2. 使用試劑、容器等無RNase污染。
②PCR反應(yīng)程序：
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循環(huán)步驟 |
溫度 |
時間 |
循環(huán)數(shù) |
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變性 |
98℃ |
10s |
30 |
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延伸 |
68℃ |
10s |
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保持 |
4℃ |
∞ |
③電泳檢測：
使用2%瓊脂糖膠，取5μL PCR反應(yīng)液電泳檢測條帶大小及亮度，用100bp DNA Ladder（貨號：10507）標(biāo)定，其大小為120bp左右單一條帶。
B.體外轉(zhuǎn)錄sgRNA
①按下列體系室溫配制反應(yīng)體系：
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組分 |
體積（μL） |
終濃度 |
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RNase free H2O |
Up to 20 |
- |
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10×sgRNA Reaction Buffer |
2 |
1× |
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NTPs (25 mM each) |
8 |
10 mM each |
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sgRNA模板（上述A獲得） |
5 |
- |
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10×sgRNA Enzyme Mix |
2 |
1× |
注： 1. 低溫配置可能引起DNA模板沉淀。
2. 使用試劑、容器等無RNase污染。
②反應(yīng)程序：
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溫度 |
時間 |
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37℃ |
4h |
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4℃ |
∞ |
注：反應(yīng)于PCR儀中進(jìn)行，熱蓋打開，防止長時間導(dǎo)致反應(yīng)液蒸發(fā)。
③DNA模板消化：
反應(yīng)完成后，每管加入2μL DNaseⅠ（RNase free），37℃孵育15min以去除模板DNA。
④轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化：
體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可選用 RNA Cleaner 磁珠進(jìn)行純化（貨號：12602），也可以采用酚/氯仿純化法（具體操作步驟可聯(lián)系Yeasen索?。?，以去除蛋白、游離的核苷酸等。
HB200916
