本產(chǎn)品是大腸桿菌重組表達來源的噬菌體T7 RNA聚合酶，以含有T7啟動子序列（5’-TAATACGACT CACTATAG*-3’）的雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動子下游的反向單鏈DNA互補的RNA。雙鏈線性平末端或5’突出末端DNA均可作為T7 RNA聚合酶的底物模板，因此線性質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物均可用作體外合成RNA的模板。

注：G*為RNA轉(zhuǎn)錄的第一個堿基。

 

產(chǎn)品組分

編號	組分	產(chǎn)品編號/規(guī)格
		10618ES90 (5000 U)	10618ES96 (25000 U)	10618ES97 (50000 U)
10618-A	T7 RNA polymerase (50 U/μL)	100 μL	500 μL	1 mL
10618-B	10×Transcription Buffer	400 μL	1 mL ×2	1 mL ×4

注：10×Transcription Buffer中含460 mM MgCl2和100 mM DTT，但不含有NTP，如需請購買本公司NTP set solution 10133。

 

產(chǎn)品應(yīng)用

1. 單鏈 RNA合成（包括mRNA，siRNA，gRNA等各類RNA前體，以及同位素標記或非同位素標記的RNA探針）

2. 以（Cap analog）為引物合成Capped mRNA

 

酶活定義

在 37℃、pH8.0 的條件下，1h內(nèi)使1 nmol 的 [3H] GMP 摻入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定義為1個活性單位。

 

運輸和保存方法

干冰運輸。-20℃保存，有效期一年。

 

質(zhì)量控制

核酸外切酶殘留檢測：100 U的本酶和0.5 μg λ DNA-Hind III酶切產(chǎn)物37℃下孵育4 h，DNA的電泳譜帶不發(fā)生變化。

切口酶殘留檢測：100 U的本酶和0.5 μg IL23R質(zhì)粒，37℃下孵育4 h，DNA的電泳譜帶無變化。

RNase殘留檢測：100 U的本酶和0.5 μg  293T細胞總RNA，37℃下孵育4 h，RNA的電泳譜帶無變化。

 

注意事項

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 本產(chǎn)品僅做科研用途！

 

應(yīng)用實例

按下列體系配制反應(yīng)體系

組分	體積（μL）	終濃度
10×Transcription Buffer (Mg2+ Plus)	2	1×
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each)	0.4 each	2 mM each
T7 RNA Polymerase (50 U/μL)	0.5-1	-
RNase inhibitor (40 U/μL)	1	-
RNase free H2O	Up to 18	-
模板DNA	2 (100 ng-1μg)	-

注： 1. DNA模板需要最后加入。由于10×Buffer中含有亞精胺，亞精胺濃度過高會引起DNA模板沉淀。

2. Buffer和水建議放置到室溫，然后開始使用，反應(yīng)于室溫下配制，防止溫度低引起亞精胺沉淀高濃度DNA模板。

3.若轉(zhuǎn)錄長度< 100 nt，模板投入量可增加至2 μg。

4. RNase inhibitor (40 U/μL)請購買本公司產(chǎn)品10603。

5.為了特定區(qū)域的有效轉(zhuǎn)錄，建議在其區(qū)域下游把模板DNA預先切成平端或5′突出末端。

37℃反應(yīng)1-2 h（若轉(zhuǎn)錄長度≤ 100 nt，增加時間至4-8 h）。

反應(yīng)結(jié)束后，使用2 U DNaseⅠ（無RNase）37℃ 15分鐘去除DNA模板。

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物純化：體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可選用RNA Cleaner磁珠進行純化（12602），以去除蛋白、鹽離子和其他雜質(zhì)。也可以采用酚/氯仿純化法（具體操作步驟可聯(lián)系Yeasen索?。?。

 

操作建議

1.DNA模板的種類：推薦使用含T7啟動子的線性化質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物作為模板。

2.轉(zhuǎn)錄模板的純度會顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在質(zhì)粒DNA抽提過程中殘留的RNase A會顯著影響轉(zhuǎn)錄RNA的質(zhì)量。通過酚-氯仿抽提的質(zhì)粒DNA為最佳模板；PCR產(chǎn)物建議采用膠回收純化后使用。

3.在20 μL反應(yīng)體系中加入0.02 U熱穩(wěn)定無機焦磷酸酶可顯著提高轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量。

 HB220118