Superoxide Dismutase (SOD) Activity Assay Kit, Hydroxylamine method 超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒，羥胺
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產(chǎn)品簡介
超氧化物歧化酶（SOD）是一種在生物體內(nèi)廣泛存在的酶，主要功能是保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。SOD通過催化超氧自由基（O2-）的歧化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為氧氣（O2）和過氧化氫（H2O2）。過氧化氫相比超氧自由基，其活性較低，可以被細(xì)胞內(nèi)的其他抗氧化酶等進(jìn)一步分解，從而減少氧化損傷，保護(hù)細(xì)胞。高等動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)一般只有存在于細(xì)胞質(zhì)中的SOD即銅鋅-SOD（CuZn-SOD）和存在于線粒體中的錳-SOD(Mn-SOD)，低等動(dòng)物、單細(xì)胞生物和植物中除了銅鋅-SOD（CuZn-SOD）、錳-SOD(Mn-SOD)，還有鐵-SOD（Fe-SOD）。
超氧化物歧化酶活性檢測(cè)試劑盒（羥胺法）通過黃嘌呤氧化酶法來測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）的活力，該方法基于黃嘌呤及其氧化酶反應(yīng)體系，能夠產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-）。這些自由基能夠進(jìn)一步氧化羥胺，生成亞硝酸鹽。在顯色劑的作用下，亞硝酸鹽使溶液呈現(xiàn)紫紅色。通過使用可見光分光光度計(jì)測(cè)量溶液的吸光度，可以間接反映亞硝酸鹽的濃度。當(dāng)待測(cè)樣本中存在SOD時(shí)，SOD會(huì)抑制超氧陰離子自由基的生成。由于SOD的這種抑制作用，導(dǎo)致形成的亞硝酸鹽量減少，從而使得在比色實(shí)驗(yàn)中，含有SOD的樣本（測(cè)定管）的吸光度值低于無SOD的對(duì)照樣本（對(duì)照管）。通過公式計(jì)算可求出被測(cè)樣品中的SOD活力。
該試劑盒可測(cè)血清、血漿、腦脊液、胸水、腹水、紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、心肌培養(yǎng)細(xì)胞、腎透析液、尿液、腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞、各種動(dòng)植物組織細(xì)胞、微生物等的SOD活力，且靈敏度較高，IC50=0.05 g/mL，是鄰苯三酚法的18倍。
組分信息
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組分編號(hào) |
組分名稱 |
規(guī)格 |
儲(chǔ)存條件 |
備注 |
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60741-A |
試劑一 |
5 mL |
2～8℃，如有結(jié)晶，熱水溶解后使用 |
Part 1 |
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60741-B |
試劑二 |
5 mL |
2～8℃ |
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60741-C |
試劑三 |
5 mL |
2～8℃ |
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60741-D |
試劑四稀釋液 |
5 mL |
2～8℃ |
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60741-E |
試劑五 |
粉劑×1 支 |
2～8℃，避光保存 |
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60741-F |
試劑六 |
粉劑×1 支 |
2～8℃，避光保存 |
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60741-D |
試劑四貯備液 |
350 μL |
-15～-25℃ |
Part 2 |
儲(chǔ)存條件
2～8℃避光保存，有效期6個(gè)月。
使用說明
【注：正式測(cè)定前建議取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定，以使用說明中的第8條樣本正常參考值為中間值，分別往上濃縮一倍和往下稀釋一倍，做三只樣本管和一只對(duì)照管進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，以確定最佳取樣濃度，取抑制率在45%～50%左右的這一管的樣本濃度作為最佳取樣濃度。抑制率計(jì)算公式：（對(duì)照管吸光度-測(cè)定管吸光度）÷對(duì)照管吸光度×100%】
1 準(zhǔn)備儀器
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀/半自動(dòng)生化分析儀（波長為550 nm）；恒溫水浴箱（37℃）；臺(tái)式離心機(jī)；漩渦混勻器；移液器；冰乙酸（99%以上）。
2 試劑的前處理
1）試劑一的處理：使用時(shí)按1:9的體積比加蒸餾水稀釋，配成試劑一應(yīng)用液。
2）試劑四的處理：350 μL的貯備液與5 mL的稀釋液按1∶14比例配制，用多少配多少，現(xiàn)配現(xiàn)用，配成試劑四應(yīng)用液。
3）試劑五的處理：使用時(shí)加蒸餾水37.5 mL，加熱至70℃以上溶解后備用，若加熱過程中水分蒸發(fā)減少，補(bǔ)充至37.5 mL。
4）試劑六的處理：使用時(shí)加蒸餾水37.5 mL，常溫溶解后備用。
5）顯色劑的配制：試劑五溶液:試劑六溶液:冰乙酸以3:3:2 的體積比配制，用多少配多少?！?/font>注：試劑五、試劑六必須分開進(jìn)行配制，不可將試劑五、試劑六混合后再進(jìn)行配制，否則不顯色】
3 樣品的前處理
1）血清、血漿、心肌灌流液、腎透析液、細(xì)胞培養(yǎng)液等樣本可直接測(cè)定，如超過線性范圍用生理鹽水稀釋后測(cè)定。
2）組織樣本的前處理
準(zhǔn)確稱取動(dòng)物組織重量，按重量（g）：體積（mL）=1：9的比例，加入9倍體積的勻漿介質(zhì)(推薦0.86%或0.9%的生理鹽水)，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，制備成10%的勻漿液。
3）高脂血癥血清（漿）樣本的前處理
①輕度高脂血癥（外觀略有混濁）：加等量的生理鹽水稀釋，然后進(jìn)行檢測(cè)；
②中度高脂血癥（外觀混濁較明顯）：加等量的生理鹽水，再加血清1/2量（體積比）的無水乙醇混勻，然后進(jìn)行檢測(cè)；
③重度高脂血癥：50 μL高脂血清（漿）加生理鹽水200 μL混勻，加無水乙醇150 μL，充分混勻1分鐘，再加入三氯甲烷150 μL，充分混勻1分鐘，3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清檢測(cè)。
4）紅細(xì)胞樣本的前處理
a采集新鮮血、或肝素抗凝的靜脈血或動(dòng)脈血50 μL，加入含有1～2 mL生理鹽水的刻度離心管中，500～1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘。
b用移液器吸去上清液（要吸干凈），留沉淀的紅細(xì)胞。
c在沉淀的紅細(xì)胞中加入蒸餾水0.2 mL，混勻，需使紅細(xì)胞充分溶解（將溶血液對(duì)光觀看，呈透明狀則已充分溶解）。
d加入95%乙醇0.1 mL，振蕩30秒。
e加入三氯甲烷（氯仿）0.1 mL置旋渦混勻器充分抽提混勻一分鐘，3500轉(zhuǎn)/分，離心8分鐘。此時(shí)液體分三層：上層為SOD 抽提液，中層為血紅蛋白沉淀物，下層為三氯甲烷。若上清有混濁可加入少量NaCl后再離心5分鐘，即可澄清。記錄上清液體積，取5～20 μL，余下的紅細(xì)胞抽提液可放冰箱冷凍以備后用?！咀ⅲ鹤罴讶恿恳?，確定最佳取樣量后再按下表進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。】
大、小鼠可取內(nèi)眥血，用玻璃毛細(xì)管從內(nèi)眥部斜向咽喉方向刺入，或者剪尾取血，將血滴在含肝素并烤干的玻片上（烤
干時(shí)溫度要低于60℃），再用移液器取50 μL血，作SOD抽提。血量少時(shí)可取10～20 μL抗凝全血（做慢性動(dòng)物試驗(yàn)，
在飼養(yǎng)過程中可以反復(fù)取血 5～6次）。
5）植物/藥材樣本的前處理
準(zhǔn)確稱取植物組織重量，按重量（g）：體積（mL）=1：4的比例，加入4倍體積的勻漿介質(zhì)(0.1 mol/L，pH 7.0～7.4的磷酸鹽緩沖液,41403ES)，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，3500～4000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，取上清液進(jìn)行測(cè)定?！咀ⅲ鹤罴讶恿恳鳎_定最佳取樣量后再按下表進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)?！?/font>
4 操作步驟
1）調(diào)節(jié)波長：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀/半自動(dòng)生化分析儀（比色測(cè)定波長為550 nm）。
2）按操作表依次加入各試劑。
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試劑 |
測(cè)定管（mL） |
對(duì)照管（mL） |
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試劑一應(yīng)用液 |
1.0 |
1.0 |
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樣品/蒸餾水 |
樣品0.05 |
蒸餾水0.05 |
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試劑二 |
0.1 |
0.1 |
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試劑三 |
0.1 |
0.1 |
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試劑四應(yīng)用液 |
0.1 |
0.1 |
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用旋渦混勻器充分混勻，37℃恒溫水浴40分鐘，當(dāng)室溫低于20℃時(shí)孵育時(shí)間可適當(dāng)延長至45分鐘。 |
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顯色劑 |
2.0 |
2.0 |
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混勻，室溫放置10分鐘，于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，比色。 |
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5 計(jì)算公式
1）血清、血漿、心肌灌流液、腎透析液、細(xì)胞培養(yǎng)液等樣本計(jì)算公式：
定義：每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）。
總SOD活力（U/mL）=（對(duì)照OD值-測(cè)試OD值）÷對(duì)照OD值÷50% x 反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù) x 樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)
2）動(dòng)物組織/細(xì)胞樣本計(jì)算公式：
定義：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）。
總SOD活力（U/mgprot）=（對(duì)照OD值-測(cè)試OD值）÷對(duì)照OD值÷50% x 反應(yīng)液總體積（mL）÷取樣量（mL）÷相同勻漿濃度下的蛋白含量（mgprot/mL）【注：mgprot為毫克蛋白數(shù)】¸
3)植物組織勻漿中總SOD活力計(jì)算公式：
方法一(根據(jù)組織勻漿濃度進(jìn)行換算)
定義：每克組織在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）。
總SOD活力（U/g組織濕重）=（對(duì)照OD值-測(cè)試OD值）÷對(duì)照OD值÷50% x 反應(yīng)液總體積（mL）÷取樣量（mL）÷勻漿濃度（g/mL）【注：勻漿濃度（g/mL）=組織濕重(g)/勻漿介質(zhì)體積(mL)】¸
方法二(根據(jù)蛋白濃度進(jìn)行換算)
定義：每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）。
總SOD活力（U/mgprot）=（對(duì)照OD值-測(cè)試OD值）÷對(duì)照OD值÷50% x 反應(yīng)液總體積（mL）÷取樣量（mL）÷相同勻漿濃度下的蛋白含量（mgprot/mL）【注：mgprot為毫克蛋白數(shù)】
6 取樣濃度參考值
1)人血漿（血清）、1%組織勻漿和胞漿一般為2倍稀釋或不稀釋；
2)心肌灌流液、腎透析液、白細(xì)胞懸液和細(xì)胞培養(yǎng)液一般增加取樣量到100～200 μL；
3)紅細(xì)胞抽提液一般要再稀釋5倍；
4)小鼠血漿（血清）2.5倍左右稀釋；
5)大鼠紅細(xì)胞抽提液要稀釋10倍左右；
6)所有樣本用生理鹽水或緩沖液稀釋1倍后則取樣量可加大1倍。
7 最佳取樣濃度的調(diào)整
若百分抑制率大于60%時(shí)（曲線為平坦部分），則需將樣品濃度稀釋后再測(cè)試。若百分抑制率小于15%時(shí)，則需將樣品量加大或用更高濃度再測(cè)。若百分抑制率大于60％或小于10％，各個(gè)測(cè)定組的結(jié)果在檢驗(yàn)運(yùn)行中常常無顯著性差異。
8 樣本正常參考值
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物種 |
樣本 |
T-SOD活力范圍 |
參考稀釋倍數(shù) |
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小鼠 |
血清/漿 |
110.446±21.325 U/mL |
2.5倍稀釋 |
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肝組織 |
269.274±23.448 U/mgprot |
稀釋到0.25％組織勻漿濃度 |
|
|
腦組織 |
108.790±13.494 U/mgprot |
稀釋到1％組織勻漿濃度 |
|
|
腎組織 |
154.277±15.646 U/mgprot |
稀釋到0.5％組織勻漿濃度 |
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心肌組織 |
174.330±19.961 U/mgprot |
稀釋到1％組織勻漿濃度 |
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皮膚組織 |
69.01+19.95 U/mgprot |
稀釋到1％組織勻漿濃度 |
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骨骼肌 |
101.717±12.190 U/mgprot |
稀釋到1％組織勻漿濃度 |
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大鼠 |
血清/漿 |
262.786±23.240 U/mL |
10倍稀釋 |
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全血 |
21.554±2.116 U/mgHb |
/ |
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肝組織 |
214.689±38.803 U/mgprot |
稀釋到0.25％組織勻漿濃度 |
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腎組織 |
136.825±24.763 U/mgprot |
稀釋到0.5％組織勻漿濃度 |
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腸組織 |
74.738±11.351 U/mgprot |
稀釋到1％組織勻漿濃度 |
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腦皮質(zhì)組織 |
79.037±3.996 U/mgprot |
稀釋到1％組織勻漿濃度 |
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海馬組織 |
136.863±36.472 U/mgprot |
稀釋到1％組織勻漿濃度 |
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心肌組織 |
128.292±9.219 U/mgprot |
稀釋到0.5％組織勻漿濃度 |
|
|
肺組織 |
35.542±15.465 U/mgprot |
稀釋到2％組織勻漿濃度 |
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腦組織 |
140.177±26.878 U/mgprot |
稀釋到1％組織勻漿濃度 |
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雞 |
血清 |
213.208±73.368 U/mL |
/ |
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兔 |
血清 |
429.04+31.60 U/mL |
5倍稀釋 |
|
牛 |
血清 |
123.691±20.008 U/mL |
/ |
|
胃液 |
27.880±8.076 U/mL |
/ |
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人 |
血清 |
104.2+18.8 U/mL |
n=100人，2倍稀釋 |
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紅細(xì)胞 |
19246+132 U/gHb |
n=40人，5倍稀釋 |
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全血 |
21.554±2.117 U/mgHb |
/ |
注意事項(xiàng)
- 為使試劑充分溶解，所有配制的試劑可在測(cè)試前一天配好（試劑四除外），測(cè)試前試劑及樣品穩(wěn)定至室溫后再用。
- 為避免誤差，樣品和試劑要垂直加入試管，不要加在管壁上。
- 水浴或氣浴前要用旋渦混勻器充分混勻。
- 對(duì)照管建議做2支，取其平均值；或每9支測(cè)定管做1支對(duì)照管。
- 高等動(dòng)物體中只有二種CuZn-SOD與Mn-SOD，二者相加等于T-SOD；單細(xì)胞動(dòng)物及植物中還含有Fe-SOD，所以同一份標(biāo)本測(cè)T-SOD與Mn-SOD或者是測(cè)T-SOD與CuZn-SOD時(shí)，或者是測(cè)T-SOD與Fe-SOD時(shí)只需測(cè)其中一對(duì)即可。
- 使用抗凝劑收集血漿時(shí)，不能用EDTA作為抗凝劑，因?yàn)?/font>EDTA會(huì)螯合重金屬酶，導(dǎo)致SOD活性降低。
- 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
- 本產(chǎn)品僅作科研用途！
Ver.CN20241104
