產(chǎn)品描述

總一氧化氮檢測(cè)試劑盒（Total Nitric Oxide Assay Kit, 即Nitrate/Nitrite Assay Kit）采用了硝酸鹽還原酶(Nitrate reductase)還原硝酸鹽(nitrate)為亞硝酸鹽(nitrite)，然后通過(guò)經(jīng)典的Griess reagent檢測(cè)亞硝酸鹽，從而測(cè)定出總一氧化氮。一氧化氮本身極不穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)很快代謝為硝酸鹽和亞硝酸鹽，通過(guò)上述方法檢測(cè)出所有的硝酸鹽和亞硝酸鹽的量，就可以推算出總的一氧化氮的量。

本試劑盒采用的是NADPH依賴性硝酸鹽還原酶(NADPH-dependent nitrate reductase)。高濃度的NADPH會(huì)干擾后續(xù)的檢測(cè)，因此在Griess Reagent檢測(cè)之前需要消除過(guò)量NADPH對(duì)后續(xù)試驗(yàn)的干擾。乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)是常用的NADPH消除試劑，通過(guò)其清除作用，保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本試劑盒具有以下特點(diǎn)：1）檢測(cè)靈敏度高：對(duì)亞硝酸鹽的檢測(cè)下限達(dá)到2 μmol/L，在2-80 μmol/L的范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。濃度過(guò)高的樣品可以適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)。2）適用范圍廣：對(duì)于各種樣品的檢測(cè)，包括細(xì)胞、組織、細(xì)胞或組織的培養(yǎng)液、血清、血漿或尿液等。3）抗干擾能力強(qiáng)：酚紅和10%血清對(duì)測(cè)定無(wú)明顯干擾。4）樣品用量少：僅需0-60 μL樣品，取決于樣品內(nèi)一氧化氮的濃度。5）檢測(cè)周期短：僅需約80 min即可完成檢測(cè)。

 

產(chǎn)品組分

編號(hào)	組分	產(chǎn)品貨號(hào)（規(guī)格）		保存方法
		50107ES50 (50 T)	50107ES70 (200 T)
50107-A	Assay Buffer 反應(yīng)緩沖液	15 mL	15 mL	-20 ℃
50107-B	Enzyme Cofactor 反應(yīng)輔酶	5 mg	5 mg	-20 ℃避光
50107-C	Enzyme Enhancer反應(yīng)增強(qiáng)子	550 μL	1.1 mL×2	-20 ℃
50107-D	Nitrate Reductase硝酸還原酶	250 μL	1 mL	-20 ℃避光
50107-E	LDH Buffer LDH 緩沖液	550 μL	1.1 mL ×2	-20 ℃
50107-F	LDH乳酸脫氫酶	500 μL	1 mL×2	-20 ℃
50107-G	Nitrite Standard亞硝酸鹽標(biāo)品(1 M)	1 mL	1 mL	-20 ℃避光
50107-H	Griess Reagent I Griess 試劑 I	3 mL	12 mL	-20 ℃避光
50107-I	Griess Reagent II Griess 試劑 II	3 mL	12 mL	-20 ℃避光

 

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸。-20 ℃保存，有效期一年。反應(yīng)輔酶配制成溶液后必須分裝并-70 ℃保存。

 

注意事項(xiàng)

1）RPMI 1640等含有較高濃度硝酸鹽的培養(yǎng)液易對(duì)本試劑盒的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，請(qǐng)盡量避免。必須使用RPMI 1640培養(yǎng)液時(shí)，在檢測(cè)一氧化氮前必需先換成其他適當(dāng)培養(yǎng)液如；DMEM、MEM、F12等，或HBSS或PBS緩沖液等。

2）檢測(cè)反應(yīng)必須避光進(jìn)行。

3）由于檢測(cè)過(guò)程中涉及還原反應(yīng)，因此影響還原反應(yīng)的氧化或還原試劑要注意避免，如還原劑DTT和巰基乙醇。

4）本產(chǎn)品僅作科研用途！

 

檢測(cè)步驟

1. 樣品處理

含有高濃度蛋白的樣品如血清、含有高濃度血清的細(xì)胞培養(yǎng)液等，在加入Griess Reagent I后可能產(chǎn)生沉淀。可取50 μL樣品，加入50 μL Griess Reagent I進(jìn)行測(cè)試，觀察是否產(chǎn)生沉淀。如產(chǎn)生沉淀，可把樣品沸水浴加熱5 min，以變性蛋白，然后12,000 g離心5 min，取上清用于后續(xù)的測(cè)定。對(duì)于細(xì)胞或組織樣品可以使用無(wú)蛋白酶或者磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行裂解。對(duì)于尿液樣品，通常需要用水稀釋10-50倍后檢測(cè)。不宜使用肝素抗凝的血漿，肝素抗凝的血漿在和Griess Reagent反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生沉淀。

 

2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品

用制備或者稀釋樣品所使用的溶液把1M亞硝酸鹽標(biāo)品稀釋成 2、5、10、20、40、 60、80 μmol/L。例如樣品為細(xì)胞裂解液，則用該裂解液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；樣品為細(xì)胞培養(yǎng)液，則用該培養(yǎng)液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。如果樣品為血清，則可以使用本試劑盒提供的反應(yīng)緩沖液（50107-A)或簡(jiǎn)單地使用PBS、生理鹽水等適當(dāng)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。  

 

3. 試劑的準(zhǔn)備

a. 加約1 mL蒸餾水或MilliQ級(jí)純水至5 mg反應(yīng)輔酶(50107-B)中，顛倒混勻溶解后，再用蒸餾水或 MilliQ級(jí)純水定容至3 mL，配制成2 mM反應(yīng)輔酶溶液，除立即使用的部分外，其余反應(yīng)輔酶溶液必須立即分裝后-70 ℃凍存。

b. 反應(yīng)增強(qiáng)子(50107-C)已經(jīng)配制在適當(dāng)溶液中。反應(yīng)增強(qiáng)子可以適當(dāng)分裝后-20 ℃或-70 ℃保存。

c. 硝酸還原酶(50107-D)和LDH (50107-F)在臨用前取出，并放置在冰浴上使用（注意在使用完畢后立即-20 ℃保存）。試劑盒中的其余各種試劑在溶解后保存在冰浴上。Griess Reagent I和Griess Reagent II在使用前需達(dá)到室溫。

 

4. 參考下表依次加入標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和檢測(cè)試劑并進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)：

	空白對(duì)照	標(biāo)準(zhǔn)品	樣品
標(biāo)準(zhǔn)品	—	60 μL	—
樣品	—	—	x μL
用于樣品稀釋的溶液	60 μL	—	(60-x) μL
反應(yīng)輔酶（2mM）	5 μL	5 μL	5 μL
反應(yīng)增強(qiáng)子	10 μL	10 μL	10 μL
硝酸還原酶	5 μL	5 μL	5 μL
混勻后，37 ℃孵育30 min
LDH 緩沖液	10 μL	10 μL	10 μL
LDH	10 μL	10 μL	10 μL
混勻后，37℃孵育30 min
Griess 試劑 I	50 μL	50 μL	50 μL
Griess 試劑 II	50 μL	50 μL	50 μL
混勻后，室溫（20-30 ℃）孵育10 min后測(cè)定A540吸光度值

【注】：a.反應(yīng)必須避光進(jìn)行。如果使用96孔板進(jìn)行檢測(cè)，可以使用鋁箔紙包裹96孔板進(jìn)行避光。

b.樣品的用量上限為60 μL，血清、血漿或組織勻漿液通常使用40 μL。樣品不足60 μL時(shí)，不同樣品之間的體積最好能保持一致，體積不足的部分用用于樣品稀釋的溶液補(bǔ)足。用于樣品稀釋的溶液是指實(shí)際用于樣品稀釋的溶液或裂解樣品的溶液。標(biāo)準(zhǔn)品可以參考上表直接使用60 μL。

c.可以同時(shí)設(shè)置加入200 μL水或PBS的2-3個(gè)孔為陰性對(duì)照，這2-3個(gè)孔僅僅加入水或PBS，不再加入任何其他試劑。

d.第一部分37 ℃孵育30 min后，直接參考上表依次加入LDH緩沖液和LDH，并進(jìn)行后續(xù)孵育。

e.第二部分37 ℃孵育30 min，直接參考上表依次加入Griess 試劑I和Griess 試劑 II。加入Griess試劑 I后需要輕輕混勻。

f.每次混勻后，可以1000-3000 g離心數(shù)秒，把液體沉淀到管底。同時(shí)需避免各檢測(cè)孔中產(chǎn)生氣泡，以免氣泡干擾檢測(cè)結(jié)果。

g.檢測(cè)時(shí)，如無(wú)540 nm濾光片，520-560 nm的濾光片也可以使用。如無(wú)酶標(biāo)儀或合適的濾光片，也可以通過(guò) 數(shù)碼相機(jī)拍照后在適當(dāng)圖形軟件中進(jìn)行定量分析，并 確定樣品中一氧化氮的濃度。拍照比色時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品需要更為精細(xì)的濃度梯度。