近日，翌圣生物科技（上海）股份有限公司（以下簡(jiǎn)稱“翌圣生物”）收到美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（以下簡(jiǎn)稱“FDA”）的確認(rèn)函，公司遞交的T7 RNA polymerase的DMF資料已被美國(guó)FDA接收，獲得備案編號(hào)，完成了DMF備案。如需引用DMF編號(hào)，請(qǐng)發(fā)郵件至marketing@yeasen.com提出授權(quán)申請(qǐng)，與您確認(rèn)后，我們將向您提供DMF授權(quán)書。翌圣生物更多產(chǎn)品正在申報(bào)美國(guó)FDA DMF備案，歡迎來電、來函咨詢。統(tǒng)一客服電話400-6111-883。

 

 

進(jìn)行FDA DMF備案的目的是什么？
 

DMF（Drug Master File）是DMF持有者遞交給FDA的存檔文件，內(nèi)容包含用于人體的藥物產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工、包裝和儲(chǔ)存過程中用到的生產(chǎn)設(shè)施、工藝流程、質(zhì)量控制及其所用原料、包裝材料等詳細(xì)信息。DMF持有者向FDA遞交DMF的主要目的是支持用戶向FDA提交的各種藥品申請(qǐng)（一種或多種臨床研究申請(qǐng)（IND）、創(chuàng)新藥申請(qǐng)（NDA）、仿制藥注冊(cè)（ANDA）、出口申請(qǐng)、以及上述各種申請(qǐng)的修正和補(bǔ)充）。FDA對(duì)遞交的DMF資料進(jìn)行存檔處理，以備審查。DMF持有者只需向用戶提供授權(quán)書，授權(quán)FDA在評(píng)審用戶的藥品申請(qǐng)時(shí)，對(duì)所涉及的DMF進(jìn)行全面考查。這樣的DMF制度使藥物申報(bào)者可以直接使用DMF備案編號(hào)來代替申報(bào)過程中需要提供有關(guān)原料和輔料的具體信息，節(jié)約了審批成本，提高了審批效率，同時(shí)還能縮短注冊(cè)周期。

 

什么是T7 RNA polymerase？
 

T7 RNA polymerase能以含有T7啟動(dòng)子序列的雙鏈DNA為模板，以NTPs為底物，合成與啟動(dòng)子下游單鏈DNA互補(bǔ)的RNA，因此，T7 RNA polymerase常應(yīng)用于體外合成長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本和短轉(zhuǎn)錄本。雙鏈線性平末端或5’突出末端DNA均可作為T7 RNA polymerase的轉(zhuǎn)錄模板，因此線性質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物均可用作體外合成RNA的模板。翌圣生物可為您提供GMP級(jí)別的T7 RNA polymerase，以1 μg的模板投入量可以產(chǎn)生 100-200 μg的RNA。

 

常見問題及解決方案 
 

1. 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)量低

模板的質(zhì)量與產(chǎn)量密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)量明顯低于對(duì)照組可能原因有：

①實(shí)驗(yàn)?zāi)０逯杏幸种品磻?yīng)成分；

②實(shí)驗(yàn)?zāi)０灞旧碓颉?/span>

建議：

①重新純化模板；

②確定模板定量以及其完整性；

③延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間；

④加大模板投入量；

⑤嘗試其它的啟動(dòng)子和RNA聚合酶。

2. 短轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)量低

轉(zhuǎn)錄起始片段短會(huì)抑制反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物小于100nt 時(shí)，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間至 4-8 小時(shí)或增加模板量至2ug可以提高RNA產(chǎn)量。

3. RNA 轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度大于預(yù)期

如果電泳顯示產(chǎn)物條帶大于預(yù)期大小，可能原因：

①質(zhì)粒模板可能沒有完全線性化；

②有義鏈3’端為突出結(jié)構(gòu)；

③RNA存在未完全變性的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

建議：

①檢查模板是否完全線性化，如有必要，額外進(jìn)行線性化；

②選擇合適的限制性內(nèi)切酶，避免產(chǎn)生有義鏈3’ 端突出，或者用 Klenow Fragment 或 T4 DNA 聚合酶補(bǔ)齊后，再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；

③使用變性膠檢測(cè)RNA 產(chǎn)物。

4. RNA 轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度小于預(yù)期

如果電泳顯示產(chǎn)物條帶小于預(yù)期大小，可能原因：

①模板包含類似于T7 RNA聚合酶的終止序列；

②模板中GC含量高。

建議：

①降低反應(yīng)溫度（比如，30℃），有時(shí)降低溫度可以增加轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度，但會(huì)降低產(chǎn)量?；蛘邍L試不同的 RNA 聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；

②若模板GC含量高，采用 42℃進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或者添加 SSB 提高產(chǎn)量及轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度。

5. 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳拖尾

電泳過程中有拖尾現(xiàn)象，可能原因：

①實(shí)驗(yàn)操作過程被RNase污染；

②DNA模板被RNase污染。

建議：

①實(shí)驗(yàn)過程中使用RNase-free的槍頭和EP管，佩戴一次性乳膠手套和口罩，所有試劑均用RNase-free H₂O配制。

② 重新純化模板 DNA。

 
相關(guān)產(chǎn)品
 

產(chǎn)品名稱	貨號(hào)	規(guī)格
UCF.ME® T7 RNA Polymerase GMP-grade（50U/μL）	10624ES90	5000 U
	10624ES97	50000 U
UCF.ME® T7 RNA Polymerase GMP-grade（250 U/μL）	10625ES10	10 KU
	10625ES60	100 KU