非特異擴(kuò)增是PCR實(shí)驗(yàn)中的常見問題，非特異擴(kuò)增直接影響檢測結(jié)果的判讀并且會導(dǎo)致擴(kuò)增靈敏度下降，甚至目標(biāo)片段的得率下降等。此外，檢測試劑的穩(wěn)定性也是核酸檢測行業(yè)人格外關(guān)注的問題，不管是長期儲存穩(wěn)定性還是短期偏離正常保存條件的穩(wěn)定性，都直接影響檢測結(jié)果的有效性。

 

翌圣生物科技（上海）股份有限公司（以下簡稱“翌圣生物”）匠心開發(fā)出熱啟動Taq酶雙封閉抗體，通過同時(shí)封閉Taq酶的聚合酶活性及外切酶活性來有效提高擴(kuò)增的特異性及試劑的穩(wěn)定性。

PART 01

Taq酶雙封閉抗體封閉原理

 

傳統(tǒng)的Taq DNA聚合酶抗體可以有效抑制Taq酶的聚合酶活性，從而避免錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。然而Taq酶除了具有5'→3'聚合酶活性，還有5'→3'核酸外切酶活性，這部分外切酶活性可能會在低溫時(shí)導(dǎo)致錯(cuò)配探針或其它物料降解，造成非特異信號。翌圣生物開發(fā)的熱啟動Taq酶雙封閉抗體不僅可以封閉Taq酶的有5'→3'聚合酶活性，還能同時(shí)封閉Taq酶的5'→3'外切酶活性，雙管齊下，既能有效防止錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，又能防止物料降解產(chǎn)生非特異信號，雙重提升試劑的穩(wěn)定性。

圖1. 翌圣雙封閉抗體封閉原理示意圖

圖中高亮部分為Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性結(jié)構(gòu)域和5'→3'核酸外切酶活性結(jié)構(gòu)域，翌圣雙封閉抗體含兩種抗體，可同時(shí)封閉Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性

 

PART 02

Taq酶雙封閉抗體使用方案

 

翌圣生物Taq酶雙封閉抗體不僅可封閉野生型Taq酶，對于多種突變體Taq酶亦可適用，封閉之后的熱啟動Taq酶可以正常保存至-20℃。

1 µL抗體（5 mg/mL）可封閉20-50 U Taq DNA聚合酶：

•  小樣室溫（25℃）旋轉(zhuǎn)混勻孵育30 min

•  大樣室溫（25℃）旋轉(zhuǎn)混勻孵育2~3 h

PART 03

Taq酶雙封閉抗體性能展示

 

 1  雙封閉抗體有效封閉Taq DNA聚合酶外切酶活性

將合成的引物探針分別配于未封閉以及雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶的反應(yīng)液中，40℃反應(yīng)，檢測兩者熒光信號。

圖2. 雙封閉抗體外切酶活性封閉效率檢測

黃色：未封閉的Taq DNA聚合酶組；紫色：雙封閉抗體封閉的Taq DNA聚合酶組

 

由圖2可以看出雙封閉抗體可有效封閉Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

 

 2   使用雙封閉抗體分型準(zhǔn)確，靈敏度更高

分別用翌圣生物雙封閉抗體以及T公司抗體對Taq酶封閉后通過ARMS-PCR技術(shù)檢測陽性樣本。

 

圖3. ARMS-PCR擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色：T公司封閉抗體封閉；紅色：翌圣雙封閉抗體封閉

 

由圖3可以看到翌圣生物雙封閉抗體封閉的Taq酶在ARMS-PCR擴(kuò)增中分型準(zhǔn)確，靈敏度更高。

 

 3   雙封閉抗體有效提升檢測試劑穩(wěn)定性

用傳統(tǒng)封閉抗體與雙封閉抗體分別封閉Taq DNA聚合酶，配置成含引物探針的全預(yù)混液，在4℃放置10天或在37℃放置1、3、5天，擴(kuò)增10000拷貝ASFV質(zhì)粒，觀察擴(kuò)增曲線和Ct值變化，對比傳統(tǒng)封閉抗體和雙封閉抗體對全預(yù)混反應(yīng)液穩(wěn)定性的作用。

圖4. 傳統(tǒng)封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASFV質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色：4℃放置10天；紅色：4℃放置0天（對照）

由圖4可以看出，雙封閉抗體比傳統(tǒng)封閉抗體更能保持反應(yīng)液穩(wěn)定，有效提升檢測試劑穩(wěn)定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預(yù)混液4℃放置10天擴(kuò)增曲線和Ct值無明顯變化。

 

圖5. 傳統(tǒng)封閉抗體(A)、雙封閉抗體(B)封閉反應(yīng)液擴(kuò)增10000拷貝ASFV質(zhì)粒擴(kuò)增曲線圖

藍(lán)色：37℃放置5天 ；綠色：37℃放置3天；黃色：37℃放置1天 ； 紅色：37℃放置0天（對照）

由圖5可以看出，雙封閉抗體比傳統(tǒng)封閉抗體更能保持反應(yīng)液穩(wěn)定，有效提升檢測試劑穩(wěn)定性。雙封閉抗體封閉含引物探針全預(yù)混液37℃放置1、3、5天Ct值差小于0.2。

 

 4   雙封閉抗體幫助解決基線上漂問題

某些引物配合特定buffer和儀器時(shí)，會出現(xiàn)基線上漂的情況。翌圣生物嘗試多種方法改善基線問題，發(fā)現(xiàn)雙封閉抗體更有利于基線平穩(wěn)。

圖6. N基因(A)、ACT基因(B)擴(kuò)增曲線圖

紅色：傳統(tǒng)封閉抗體封閉；綠色：雙封閉抗體封閉

由圖6可以看出特定引物和buffer下，使用雙封閉抗體可幫助解決基線上漂問題。

 

 5   使用雙封閉抗體獲得良好線性

用雙封閉抗體封閉的反應(yīng)液擴(kuò)增100000、10000、1000、100拷貝ASFV/ACT雙質(zhì)粒，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
 

 

圖7. 雙封閉反應(yīng)液制作ASFV基因(A)、ACT基因(B)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由圖7可以看到，ASFV基因標(biāo)準(zhǔn)曲線R²為0.998，擴(kuò)增效率為98.848%；ACT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線R²為0.998，擴(kuò)增效率為98.113%，兩者線性均良好，且均無非特異性擴(kuò)增。

 

 6   雙封閉抗體可快速釋放酶活

分別用進(jìn)口T公司抗體和翌圣生物雙封閉抗體封閉Taq酶，并在95℃下熱激20 s，檢測酶活?？梢钥吹?5℃熱激 20 s后，翌圣生物雙封閉抗體可釋放95%以上的酶活，與T公司抗體相當(dāng)。

	原酶	翌圣生物雙封閉抗體（95℃，20 s）	T公司抗體（95℃，20 s）
酶活-U/μL	2.15	2.1	2.2

 

 7   雙封閉抗體可封閉多種類型Taq酶

用翌圣生物雙封閉抗體（Cat#31303）分別封閉三種類型Taq酶（野生型+2種突變型），封閉比例為1μg：5U，測量熒光值以及封閉效率。可以看到，對于不同類型的Taq酶，翌圣生物雙封閉抗體（Cat#31303）封閉效果均較好。

	熒光值	封閉效率
空白	6461.74
原酶-Taq000	56221.33
原酶-Taq019E	50819.64
原酶-Taq019H	56466.33
31303-Taq000	7949.68	97.01%
31303-Taq019E	8267.35	95.93%
31303-Taq019H	8015.47	96.90%

 8   Yeasen雙封閉抗體無小鼠基因組殘留

以水為模板作為陰性對照，小鼠基因組為模板作為陽性對照，擴(kuò)增不同批次的31303，觀察條帶，發(fā)現(xiàn)樣品未擴(kuò)增出目的片段，說明抗體不存在小鼠基因組殘留。

圖8. 小鼠基因組殘留檢測圖

注：-為陰性對照，+為陽性對照，1-5為31303不同批次樣品

PART 04

翌圣生物Taq酶抗體庫，滿足您的多樣化需求

 

市面上Taq酶突變體種類較多，往往很難找到適配且能高效封閉的抗體，而選擇其他的修飾方式，可能存在修飾效果不佳、熱啟動時(shí)間過長等問題。

翌圣生物擁有多種Taq酶抗體組成的抗體庫，除常用的聚合酶活性封閉抗體、5'→3'外切酶活性封閉抗體和雙封閉抗體以外，抗體庫中還有40余株抗體，后續(xù)可快速開發(fā)實(shí)現(xiàn)超過200余株抗體，可針對各種商業(yè)化Taq酶進(jìn)行定制化篩選適配封閉抗體，幫助IVD企業(yè)快速適配原料縮短研發(fā)進(jìn)程。

抗體庫定制篩選案例展示：

2020年6月12日，客戶C反饋使用翌圣生物通用版Taq酶抗體封閉某Taq酶突變體，封閉效率可達(dá)95%，但希望37℃穩(wěn)定性測試能突破7天，嘗試優(yōu)化封閉比例未能解決該問題，遂安排寄送客戶的Taq酶至翌圣生物IVD RDC。同年7月20日，翌圣生物從其Taq酶抗體庫里進(jìn)行篩選，篩選到#301號聚合酶封閉抗體與#2號外切酶封閉抗體對客戶Taq酶有良好的封閉性，混合使用兩種抗體可使Taq酶37℃穩(wěn)定性測試延長至14天。

創(chuàng)新合作模式下的定制化封閉抗體篩選，翌圣生物Taq酶抗體庫給您多種選擇！

目前翌圣生物為IVD企業(yè)已提供的定制化服務(wù)除了Taq酶封閉抗體篩選外，其他分子診斷原料包括：免提取、快速程序、自動化儀器適配、小體積反應(yīng)體系、酶定向改造、防污染體系、凍干試劑等，幫助數(shù)百個(gè)分子診斷試劑開發(fā)項(xiàng)目順利進(jìn)行，快速推向臨床實(shí)驗(yàn)階段。

 

如果您對創(chuàng)新合作模式感興趣，歡迎聯(lián)系我們（聯(lián)系電話：18930337563）探討交流，我們期待與您的合作！

 

PART 05

產(chǎn)品信息

 

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody	31303ES60	100 μg
	31303ES80	1 mg
	31303ES90	5 mg
	31303ES92	10 mg
	31303ES93	100 mg
	31303ES94	1000 mg