干貨分享|熱啟動(dòng)酶原理及耐熱機(jī)制全面解析
常規(guī)PCR技術(shù)因能夠快速擴(kuò)增任何已知的DNA片段而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。但常規(guī)型PCR技術(shù)容易出現(xiàn)引物二聚體或錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增等現(xiàn)象，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確性。熱啟動(dòng)型PCR能夠很好的解決上述問(wèn)題，是最常用的提高PCR特異性的方法。
熱啟動(dòng)酶（Hot start enzyme）主要利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱至變性溫度時(shí)修飾物失活，釋放酶活，從而使PCR反應(yīng)得以正常進(jìn)行。目前市面上常用的DNA聚合酶熱啟動(dòng)修飾方法主要有化學(xué)修飾、配體修飾和抗體修飾等，不同的熱啟動(dòng)修飾方法原理上有所區(qū)別，各有優(yōu)劣勢(shì)。
化學(xué)法
DNA聚合酶的化學(xué)法修飾，一般采用化學(xué)小分子如酸酐等有機(jī)物與聚合酶上的側(cè)鏈氨基酸（賴(lài)氨酸）通過(guò)化學(xué)反應(yīng)相互作用，使酶低溫時(shí)失去酶活，溫度升高后，酸酐與氨基之間的化學(xué)鍵斷裂，酶活釋放，從而達(dá)到熱啟動(dòng)效果。化學(xué)修飾可有效封閉酶的活性，操作簡(jiǎn)單，但酶活性釋放速度較慢，依賴(lài)溫度激活DNA聚合酶，能有效抑制非特異性產(chǎn)物，可在室溫下配置反應(yīng)體系，且對(duì)PCR反應(yīng)buffer要求較高。
圖1. 化學(xué)法修飾熱啟動(dòng)酶原理圖
配體法
配體法修飾，主要借助核酸適配體封閉酶活。顧名思義，核酸適配體一般指一類(lèi)具有特異性識(shí)別功能的單鏈核酸分子，可以是RNA也可以是DNA，長(zhǎng)度一般為25～60個(gè)核苷酸。作為一種寡核甘酸序列的識(shí)別分子，作用的靶分子范圍廣泛，從無(wú)機(jī)金屬的小分子到生物領(lǐng)域的大分子。這些適配子可以形成特定的空間構(gòu)象，從而在表觀功能上與抗體類(lèi)似。對(duì)蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)具有高度特異性、親和力。核酸適配體通過(guò)非共價(jià)鍵與DNA聚合酶結(jié)合，進(jìn)而抑制聚合酶在非許可溫度下的聚合反應(yīng)。一般核酸適配體的篩選所需周期較短，整個(gè)過(guò)程能夠依賴(lài)自動(dòng)化，簡(jiǎn)便快捷。
圖2. 配體法修飾熱啟動(dòng)酶原理圖
抗體法
抗體法熱啟動(dòng)酶一般考慮使用DNA聚合酶抗體封閉酶活性，使其在低溫時(shí)處于無(wú)活性狀態(tài)，在加熱至變性溫度時(shí)抗體變性，解除封閉從而釋放活性，可以大大避免錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增。另一方面針對(duì)低豐度基因，封閉抗體在避免預(yù)變性前的DNA聚合酶和模板的非特異性結(jié)合的同時(shí)，增加了引物與微量的正確模板碰撞退火的效率，從而保證低豐度基因的有效檢出，大大提升反應(yīng)靈敏度和擴(kuò)增效率。
圖3. 抗體法修飾熱啟動(dòng)酶原理圖
表1. 熱啟動(dòng)酶常見(jiàn)修飾方法優(yōu)劣勢(shì)比較
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酶活封閉類(lèi)型 |
化學(xué)修飾 |
配體修飾 |
抗體修飾 |
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原理 |
化學(xué)小分子和DNA聚合酶活性中心結(jié)合封閉酶活 |
核酸適配體通過(guò)非共價(jià)鍵作用與聚合酶結(jié)合封閉酶活 |
DNA聚合酶抗體與聚合酶結(jié)合封閉酶活 |
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酶活釋放條件 |
溫度：大于95 ℃ 時(shí)間：10-15 min |
溫度：大于60 ℃ 時(shí)間：1-5 min |
溫度：大于70 ℃ 時(shí)間：30 s-5 min |
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優(yōu)點(diǎn) |
酶活性維持更加穩(wěn)定且無(wú)任何外源DNA污染，性?xún)r(jià)比較高。 |
不需要激活步驟，穩(wěn)定性高，減少樣品降解的可能性。 |
酶激活時(shí)間短，保證酶活，親和力強(qiáng)，靈敏度高。 |
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缺點(diǎn) |
酶激活時(shí)間較長(zhǎng)可能會(huì)影響酶的活性，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。 |
核酸配體是一種可逆抑制劑，不如化學(xué)修飾法穩(wěn)定，特異不夠強(qiáng)。 |
抗體修飾是一種動(dòng)態(tài)平衡，抗體生產(chǎn)成本高，試劑配比優(yōu)化時(shí)間長(zhǎng)。 |
以上簡(jiǎn)單介紹了熱啟動(dòng)酶的常見(jiàn)類(lèi)別和各種熱啟動(dòng)方法的優(yōu)劣勢(shì)，其中化學(xué)修飾物不能夠批量合成，而且需要較長(zhǎng)的激活時(shí)間聚合酶才能釋放酶活。配體修飾DNA聚合酶只在20-25°C效果較好，到40°C時(shí)，聚合酶的活性就被釋放出來(lái)，特異性不好；而抗體法修飾熱啟動(dòng)酶對(duì)應(yīng)的封閉效果最佳，酶活釋放速度快，從而大大降低PCR反應(yīng)時(shí)間，是目前IVD市場(chǎng)上應(yīng)用較多的一種熱啟動(dòng)酶改造方法。
熱啟動(dòng)酶在熱啟動(dòng)PCR的應(yīng)用方面較為廣泛，不僅有效防止非特異性PCR產(chǎn)物，而且在較難擴(kuò)增的PCR反應(yīng)如單拷貝基因的擴(kuò)增、多重PCR和超長(zhǎng)片段的擴(kuò)增等應(yīng)用尤為突出，大大改觀了傳統(tǒng)PCR技術(shù)的局限性。在病原微生物檢測(cè)、遺傳病診斷和法醫(yī)鑒定等各個(gè)領(lǐng)域等實(shí)際應(yīng)用中頗為廣泛。目前市面上應(yīng)用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR檢測(cè)試劑的核心酶基本都是抗體法熱啟動(dòng)酶。
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類(lèi)型 |
名稱(chēng) |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
價(jià)格(元） |
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抗體法熱啟動(dòng)酶 |
13086ES60/80/92/98 |
100 U/1000 U/ 10000 U/100000 U |
詢(xún)價(jià) |
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Hieff Unicon® Hotstart D-Taq DNA Polymerase |
10715ES01/03/25/60 |
100µl/1mL/ 25mL/100mL |
1652/13252/ 127852/887652 |
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封閉抗體 |
31301ES60/80/90/92/93/94 |
100 µg/ 1/5/10/100/1000 mg |
1153/3653/14653/ 26353/231753/1969552 |
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31302ES60/80/90/92/93/94 |
100 µg/ 1/5/10/100/1000 mg |
1153/3653/14653/ 26353/231753/1969552 |
【1】Michael R. Green, Joseph Sambrook. Hot Start Polymerase Chain Reaction (PCR)[J]. 2018, 2018(5):pdb.prot095125.
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HB200508
