為什么非要檢測rcAAV，rcAAV到底有什么風(fēng)險？
腺相關(guān)病毒AAV簡介
早期基因治療曾嘗試腺病毒載體，但因其免疫原性過強(qiáng)和導(dǎo)入的環(huán)狀DNA可能在細(xì)胞分裂中丟失而被AAV取代。AAV是一種無包膜單鏈DNA病毒，屬于細(xì)小病毒家族。AAV作為最早通過歐盟FDA認(rèn)證的基因治療載體，因其具有宿主范圍廣、非致病性、低免疫原性、長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因、良好的擴(kuò)散性能和物理性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)中。
目前已發(fā)現(xiàn)AAV有12種亞型及120多種變型，并逐步用于基因藥物研發(fā)。rAAV攜帶的蛋白衣殼與野生型AAV幾乎完全相同，然而衣殼內(nèi)的基因組中編碼病毒蛋白的部分被刪除，取而代之的是治療性轉(zhuǎn)基因（transgene）。
AAV基因組中唯一被保留的部分是ITRs，它起到指導(dǎo)基因組的復(fù)制和病毒載體組裝的作用。將編碼病毒蛋白刪除，一方面可以最大化重組AAV攜帶轉(zhuǎn)基因的容量，另一方面可以減小病毒載體的免疫原性和細(xì)胞毒性。
通常情況下AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時才能進(jìn)行復(fù)制。
復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)概念及法規(guī)監(jiān)管要求
在重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體生產(chǎn)過程中，轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒DNA與rAAV會由于物理接近而導(dǎo)致rAAV載體基因組、Rep/Cap基因以及ITR序列發(fā)生非同源重組，這些重組序列被誤包后就形成了具有復(fù)制能力的AAV，即復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)。
重組腺相關(guān)病毒載體收獲液、純化后的重組腺相關(guān)病毒原液、終產(chǎn)品等都可能有復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的存在。rcAAV的存在可能不會引起rAAV產(chǎn)品的顯著安全性風(fēng)險，但是會增強(qiáng)或干擾治療用rAAV 的作用效果或者導(dǎo)致rAAV載體基因序列的漂移 ，影響其基因組穩(wěn)定性以及體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等。因此，規(guī)?；a(chǎn)過程中監(jiān)測和產(chǎn)品放行時檢測rcAAV十分重要。
隨著病毒載體在CGT領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，相關(guān)法規(guī)和技術(shù)原則對監(jiān)測復(fù)制型病毒提出了建議。
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CDE 2022年發(fā)布《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》和《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》都提到病毒載體制備工藝中，復(fù)制型病毒是安全性風(fēng)險關(guān)注點(diǎn)之一，應(yīng)采用經(jīng)驗(yàn)證的方法開展檢測，如指示細(xì)胞培養(yǎng)法、直接qPCR法等。
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2020年11月歐洲的藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)EMA也發(fā)布了指南“Guideline on quality，non- clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells”，要求從病毒載體的設(shè)計上應(yīng)盡可能降低與野生型病毒相關(guān)的任何致病性，并盡可能將病毒重組和回復(fù)突變的風(fēng)險降到最低，同時在產(chǎn)品的生產(chǎn)和應(yīng)用的不同階段進(jìn)行RCL等的控制，以保障患者的用藥安全。
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2020年1月28日，F(xiàn)DA發(fā)布的《關(guān)于細(xì)胞與基因治療申請(INDs)的化學(xué)、制造和控制(CMC)指導(dǎo)原則》中提到：對于復(fù)制型腺相關(guān)病毒rcAAV的檢測，可以采用在輔助病毒存在的情況下擴(kuò)增AAV，然后進(jìn)行PCR檢測rep/ITR序列，以及在對載體制備進(jìn)行DNase消化后進(jìn)行PCR檢測rep和cap序列等。但該指導(dǎo)原則表明：不推薦用于檢測rcAAV的特定方法，藥企等應(yīng)在IND中說明所用的檢測方法和檢測靈敏度。
復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的檢測
中美歐三國監(jiān)管機(jī)構(gòu)對于復(fù)制型病毒的控制階段和檢測要求基本相同，在產(chǎn)品生產(chǎn)的各個階段以及在接受基于病毒載體的基因治療的患者后續(xù)監(jiān)測中進(jìn)行檢測。并且各監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦的復(fù)制型病毒的檢測方法均是指示細(xì)胞培養(yǎng)法，該方法是復(fù)制型病毒檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。
復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的形成主要?dú)w因于ITR中的同源序列和相鄰序列與rep/cap元件之間可能出現(xiàn)的重組事件。目前，rcAAV檢測常采用2種方法：基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測方法和qPCR快檢法（直接檢測法）。
FDA的指導(dǎo)原則建議通過全面的質(zhì)量研究確認(rèn)產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，由于下述rcAAV的兩種檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，可考慮同時采用原理互補(bǔ)的不同方法進(jìn)行研究。
基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測方法
通過不斷的細(xì)胞傳代使rcAAV實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，之后再利用qPCR或Southern-blot方法進(jìn)行檢測，保證檢測到的rcAAV都具有復(fù)制能力，是目前最常用的檢測方法。
但是該方法也有它的缺陷：檢測靈敏度依賴于AAV不同血清型對靶細(xì)胞的感染效率，檢測值可能低于實(shí)際值；培養(yǎng)方法和檢測平臺建立也有難度，需建易感細(xì)胞株、輔助病毒庫等，耗時長且投入成本較高。
qPCR快檢法（直接檢測法）
對rAAV原液或終產(chǎn)品提取核酸后，直接利用qPCR法檢測rcAAV，靶標(biāo)基因一般為ITR、Rep、Cap等的連接序列，可實(shí)現(xiàn)對rcAAV上兩種基因的檢測，提高準(zhǔn)確性。
其缺點(diǎn)為：檢測片段短，不能保證檢測目標(biāo)具備rcAAV復(fù)制所需完整序列，導(dǎo)致檢出的rcAAV不一定有復(fù)制能力，檢測值相較實(shí)際值偏高。
因此，針對rcAAV的檢測開發(fā)一款既能用于細(xì)胞培養(yǎng)后的終點(diǎn)檢測，也能用于rcAAV直接檢測的qPCR試劑盒，對于實(shí)現(xiàn)兩種檢測方法的互補(bǔ)驗(yàn)證非常有必要。
針對上述情況，翌圣生物自主研發(fā)了復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測試劑盒，基于熒光探針定量PCR原理，采用qPCR法分別檢測rAAV末端重復(fù)序列(ITR)（即參考基因Reference）和rcAAV的連接序列（即靶基因Target），實(shí)現(xiàn)對rAAV和rcAAV的同時定量檢測。還研發(fā)了與之配套使用的宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒，以及配套的自動化核酸提取儀器。用于定量分析檢測各種使用AAV2血清型的重組腺相關(guān)病毒載體進(jìn)行基因治療、腫瘤治療及疫苗研發(fā)等產(chǎn)品中可能發(fā)生的復(fù)制型腺相關(guān)病毒(rcAAV)的潛在風(fēng)險。
產(chǎn)品資質(zhì)
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符合法規(guī)：按照EP2.6.7、JP G3和USP 63藥典要求驗(yàn)證，符合國際權(quán)威機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)；
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配合審計：產(chǎn)品生產(chǎn)符合ISO13485質(zhì)量體系標(biāo)準(zhǔn)，有完善的審計文件；
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保障品質(zhì)：試劑盒所需酶原料全自產(chǎn)，且已產(chǎn)業(yè)化，供貨穩(wěn)定；
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技術(shù)經(jīng)驗(yàn)積累：TaqMan法有技術(shù)沉淀，使得Kit靈敏度高；
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專注產(chǎn)品性能：Taq酶抗體庫，雙封閉抗體提高了Kit特異性、穩(wěn)定性等。
產(chǎn)品特點(diǎn)
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抗干擾性：針對復(fù)雜基質(zhì)，樣本加標(biāo)回收率至少能達(dá)到70-130%；
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靈敏度高：定量下限(LLOQ)為2copies/μL，檢測下限(LLOD)為0.125copies/μL；
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精密度高：批內(nèi)重復(fù)性高CV＜10%，批間差異小即中間精密度CV＜15%；
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專屬性強(qiáng)：特異性檢測目的基因序列，不受其他外源基因組DNA干擾；
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防干擾強(qiáng)：引入內(nèi)部質(zhì)控(IC)，可排除樣本干擾、反應(yīng)配制異常等，避免假陰性。
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驗(yàn)證完善：參考ICH Q2（R2）分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，可提供完善的驗(yàn)證報告。
驗(yàn)證內(nèi)容
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rcAAV-2檢測驗(yàn)證項(xiàng)目 |
參考標(biāo)準(zhǔn)or要求 |
備注 |
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1、試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品（參考品） |
含有參考基因Reference和靶基因Target的質(zhì)粒DNA |
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2、線性范圍 |
標(biāo)曲范圍 |
參考說明書或?qū)嶋H情況（Reference和Target均是2×101～2×106copies/μL） |
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R2 |
≥0.98（P.s.本試劑盒≥0.99） |
藥典要求 |
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斜率 |
-3.1~-3.8（P.s.本試劑盒-3.1~-3.6） |
藥典要求 |
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擴(kuò)增效率 |
90%~110%（P.s.對應(yīng)的斜率-3.1~-3.6，行業(yè)內(nèi)要求） |
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3、準(zhǔn)確性 |
回收率 |
50%~150%（P.s.本試劑盒70~130%） |
藥典要求 |
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4、精密度 |
重復(fù)性 |
CV＜10% |
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中間精密度 |
CV＜15% |
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5、專屬性 |
不受其他來源基因組DNA的干擾 |
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6、靈敏度 |
定量限 |
Reference和Target均是2copies/uL |
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檢測限 |
Reference和Target均是0.125copies/uL |
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7、耐用性 |
儀器適用性 |
Thermo：ABI 7500、ABI QuantStudio5； Bio-Rad：CFX96 Optic Module； 上海宏石：SLAN-96S. |
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8、穩(wěn)定性 |
加速穩(wěn)定性 |
37℃穩(wěn)定14天，2~8℃穩(wěn)定30天 |
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反復(fù)凍融 |
≥10次 |
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有效期 |
-25~-15℃保存2年 |
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9、空白限 |
無模板對照（NTC） |
重復(fù)48次qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40 |
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陰性抽提對照（NCS） |
重復(fù)48次qPCR擴(kuò)增曲線CT≥40 |
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產(chǎn)品信息
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產(chǎn)品 |
貨號 |
品名 |
規(guī)格 |
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樣本前處理 試劑盒 |
18461ES |
MolPure® Magnetic Residual DNA Sample Preparation Kit 磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒（瓶裝） |
25T/100T |
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18467ES |
MolPure® Mag48 Sample Preparation Kit FN 磁珠法48孔樣本前處理試劑盒FN（預(yù)封裝) |
3×16T/ 6×16T |
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核酸提取儀器 |
80511ES |
48通道自動化核酸提取儀 |
48通量 |
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rcAAV-2檢測試劑盒 |
41327ES |
Replication-competent AAV Serotype 2 (rcAAV2) Detection Kit 復(fù)制型腺相關(guān)病毒血清型2 (rcAAV2)檢測試劑盒 |
50T/100T |
