LAMP技術(shù)之引物設(shè)計(jì)與關(guān)鍵酶原料選擇
日本學(xué)者Notomi等在2000年開(kāi)發(fā)的環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP，可在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增特異性核酸序列的目的。和常規(guī)PCR相比，LAMP技術(shù)因無(wú)需專(zhuān)用的儀器設(shè)備、擴(kuò)增時(shí)間短、靈敏度高等特點(diǎn)，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和即時(shí)診斷中顯示了良好的應(yīng)用前景。
LAMP技術(shù)實(shí)驗(yàn)雖然非常簡(jiǎn)單，但其引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜、嚴(yán)苛。正確的引物設(shè)計(jì)與高質(zhì)量關(guān)鍵酶原料的選擇是成功進(jìn)行LAMP擴(kuò)增的必要條件。
LAMP技術(shù)檢測(cè)引物類(lèi)別
LAMP技術(shù)主要是針對(duì)靶基因的6個(gè)不同的區(qū)域，包括3'端F3c、F2c和F1c區(qū)域以及5'端B1、B2和B3區(qū)域設(shè)計(jì)4~6條引物。
1.上游內(nèi)部引物-FIP
FIP引物(Forward Inner Primer)由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1C區(qū)與靶基因5’端的Flc區(qū)域序列相同。
2.上游外部引物-F3
F3引物(Forward Outer Primer)由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)。
3.下游外部引物-BIP
BIP引物（Backward Inner Primer）由B1c和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3'端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1c域與靶基因5'端的Blc區(qū)域序列相同。
4.下游外部引物-B3
B3引物(Backward Outer Primer )由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。
5.環(huán)狀引物L(fēng)oop F和Loop B
F2c的3’末端和F1c的5’末端可設(shè)計(jì)上游環(huán)狀引物L(fēng)oop F，B1的3’末端和B2的5’末端之間可設(shè)計(jì)下游環(huán)狀引物L(fēng)oop B，以提高反應(yīng)速度及檢出率。
注：LAMP技術(shù)中環(huán)狀引物L(fēng)oop F和Loop B為非必需引物，對(duì)于靈敏度要求不高的LAMP反應(yīng)可以不用Loop F和Loop B引物。
圖1. LAMP技術(shù)檢測(cè)引物類(lèi)別示意圖
圖片來(lái)源：Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): The Better Sibling of PCR? Cells. 2021 Jul 29;10(8):1931. doi: 10.3390/cells10081931. PMID: 34440699; PMCID: PMC8393631.
LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)原則
推薦使用日本榮研在線免費(fèi)LAMP引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer v5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）設(shè)計(jì)引物，上傳的DNA特異性序列＜2000 bp，靶標(biāo)序列長(zhǎng)度≤280 bp，引物設(shè)計(jì)需考慮Tm值、間距、GC含量、末端穩(wěn)定性和二級(jí)結(jié)構(gòu)等問(wèn)題。
1.引物Tm值范圍區(qū)間
F1c/B1c為64~66°C，F(xiàn)2/B2、F3/B3為59~61°C，LoopF/LoopB的Tm值為64~66°C。
2.引物間距
F2的5端與B2的5端距離為120-160 bp，F(xiàn)2的5端與F1c的5端相距40-60 bp, F2的5端到F3的3端為0-60 bp。
3.引物GC含量
一般GC含量為40-65%，當(dāng)GC含量為50-66%時(shí)效果更佳。
4.引物末端穩(wěn)定性
F2/B2、F3/B3、與LoopF/LoopB的3端和F1c/B1c的5端的 ΔG≤–4 kcal/mol。
5.二級(jí)結(jié)構(gòu)
避免引物中單堿基或雙堿基重復(fù)3次以上（如ACCC，ATATAT），避免形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，造成非特異性擴(kuò)增。
在LAMP技術(shù)中，正確的引物設(shè)計(jì)是成功進(jìn)行擴(kuò)增的前提條件，高質(zhì)量關(guān)鍵酶原料的選擇則是成功進(jìn)行LAMP擴(kuò)增的必要條件。該技術(shù)需利用鏈置換型Bst DNA聚合酶在60~65℃恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，在15-60 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)序列109-1010倍的擴(kuò)增。
LAMP技術(shù)關(guān)鍵酶原料的選擇
-鏈置換Bst DNA聚合酶
翌圣生物Hieff® Bst Plus DNA Polymerase（Cat#14402ES）是將缺少5′→3′外切核酸酶結(jié)構(gòu)域的Thermophilic Geobacillus sp DNA 聚合酶基因在E.coli中表達(dá)純化而得。該酶鏈置換能力強(qiáng)，具備高靈敏度、高擴(kuò)增效率、高dUTP耐受性的優(yōu)勢(shì)，可廣泛應(yīng)用于基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的病原體即時(shí)檢測(cè)。
1. 靈敏度低至50 copies/T，反應(yīng)時(shí)間＜15 min（熒光定量RT-LAMP法）
圖2. 用翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，擴(kuò)增新 冠病毒。25 μL反應(yīng)體系中，50 copies/T的檢出率達(dá)100%，反應(yīng)時(shí)間＜15 min。
2. 高dUTP耐受性
使用翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，擴(kuò)增新 冠病毒(20 copies/T)。在推薦反應(yīng)方案中引入dUTP/UDG酶防污染系統(tǒng)，使用dUTP替換dTTP。對(duì)比全U（35 mM）替換（紅色擴(kuò)增曲線）與T：U = 1：1（藍(lán)色擴(kuò)增曲線）的擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)體系中添加dUTP對(duì)Hieff® Bst Plus DNA Polymerase的靈敏度及擴(kuò)增效率無(wú)影響，該酶具有較高的dUTP耐受性。
圖3. 翌圣Hieff® Bst Plus DNA Polymerase高dUTP耐受性驗(yàn)證結(jié)果。
翌升LAMP相關(guān)產(chǎn)品選擇指南
